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瘋牛病夾心酶聯免疫吸附測定方法

來源:上海源葉生物科技有限公司   2011年07月09日 10:13  

本方法(PLAIA ELISA)是一種快速、準確性高的瘋牛病篩選方法之一,1999年通過歐盟認證。該方法具有反應時間短、成本低、反應步驟少的特點。瘋牛病夾心ELISA是法國原子能委員會(FrenchAtomicEnergyCommission)研制出來的一種診斷瘋牛病的快速方法,現被美國Bio-Rad公司收購。該方法又稱PLAIA~BSE試驗,它由兩種試劑盒組成,即BSE純化試劑盒和BSE檢測試劑盒。本方法的原理是用BSE純化試劑盒中的試劑和蛋白酶K對牛腦腦干部的朊毒體進行消化、純化、濃縮和溶解。BSE檢測試劑盒是用兩種單抗通過免疫酶技術對異常PrP進行檢測的試劑盒,本試劑盒可檢測180個樣本。酶標板有12X8個孔,每孔包被有一抗(PrP單抗),同時另一單抗標記了過氧化物酶。反應結束后用酶標儀讀數,測定樣本的OD值判定結果。

本方法的耗時約為5h,特異性和敏感性均為100%。

瘋牛病夾心ELISA檢測方法的主要步驟如下。

(1)BSE病原純化 從腦閂部取(350±40)mg神經組織。將樣品轉移到研磨管,用專配的細胞破碎儀勻漿一個循環45s。當研磨不充分時,可以多做1-2個循環,但注意在每個循環之間要保持管子的溫度在室溫或4~C。取勻漿液500~L樣品轉移到2ml的離心管中。取500~L配好的PK酶溶液加到離心管中,混 勻并在(37土1)℃下水浴或恒溫箱內孵育。在離心管中加入500~L試劑B,混勻直至均一的藍色。在室溫下20000g離心5min或15000g離心7rain。棄去上清液,然后用吸水紙吸干每一管。在每管中加入50t~L試劑CI, (100土1)℃下孵育(5i1)min,然后在每管中加入250gL試劑R6。

(2)BSE病原檢測 以下面的順序在各孔中加入相應溶液:A1、B1、C1、D1加入100ml+陰性對照液R3;E1、P1加入100~L陽性對照液R4;G1、H1等加入100uL已稀釋的樣品溶液。蓋上密封膜在(37土1)℃下孵育(75土15)min。洗完板后在每孔中加入100~L酶標一抗,蓋上密封膜并在2~8~C下孵育(60±5)min。洗完板后在每孔中加入100~L顯色液并在室溫下暗處孵育30min。與加顯色液的順利一致在每孔中依次加入100pL終止液。在終止反應后擦干酶標板的底部,在30min內用測量值為450nm,參考值為620nm處讀數,得到各孔的OD值。

(3)結果分析 當有一個陰性對照的OD值在正常范圍之外或超出OD平均值的40%,則該值視為脫離正軌的值,要淘汰,然后重新計算其他三個陰性對照的OD平均值,將此值作為本實驗的CUT-OFF值。如果有兩個或更多的陰性對照OD值在正常范圍之外或超出OD平均值的40%,則重做實驗。陽性對照的OD值必須大于或等于1.0。

若樣品的OD值小于CUT-OFF值則樣品視為陰性。當然,如果樣品的OD值剛剛低于CUT-OFF值(差值小于CUT-OFF值的10%),則該結果要慎重考慮,并且相應的樣品需重新實驗。若樣品的OD值大于或等于CUT-OFF值,則初次判定為陽性,并需重新實驗。重復實驗后發現樣品的OD值還是大于或等于CUT-OFF值,則判為陽性。若重新實驗后樣品的OD值低于CUT-OFF值則需用其他方法(如免疫組織化學或免疫印跡方法)進行確診。若重新實驗后實驗結果還是剛剛低于CUT-OFF值,則也需用其他方法(如免疫組織化學或免疫印跡方法)進行確診。

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