中華人民共和國國家標準

水質急性毒性的測定發光細菌法

深圳耐思特科學儀器有限公司是一家專主于研發水質急性綜合生物毒性在線監測儀器的高X技術企業，由公司自主研發的生物毒性水質自動在線預警系統在行業內*提出生物綜合毒性“定量與定性”結合的概念，使儀器智能化、物聯網的概念，針對具體的應用形成對應的解決方案與服務。欲了解更多詳情請搜索深圳耐思特科學儀器進入網站。

1主題內容與適用范圍

1.1主題內容

本標準規定了測定水環境急性毒性的發光細菌法。

1.2適用范圍

本標準適用于工業廢水、納污水體及實驗室條件下可溶性化學物質的水質急性毒性監測。

2方法提要

基于發光細菌相對發光度與水祥毒性組分總濃度呈顯著負相關（PW0. 05）,因苗可通過生物發光 光度計測定水樣的相對發光度,以此表示其急性毒性水平。

水質急性毒性水平按8所述條件選用相當的參比毒物綠化汞濃度（以mg/L為單位）來表征，或選 用EC'。值（半數有效濃度一-以樣品液百分濃度為單位）來表征。

3試劑和材料

本標準所用試劑除另有說明外,均應為符合國家標準的分析純試劑、蒸值水或同等純度的水。

3.1綠化汞HgCl2.

3.2Y化鈉NaCl,化學純。

3.3明亮發光桿菌T3小種（Photobacterium phosphoreum T3 spp.）凍干粉，安甑瓶包裝，每瓶0. 5g,在 2?5C冰箱內有效保存期為6個月.新制備的發光細菌休眠細胞（凍干粉）密度不低于每克800萬個細 胞;當按6. 2. 4步驟將凍干粉復蘇2 min后即發光（可在暗室內檢驗，肉眼應見微光），稀釋成工作液后 每毫升菌液不低于1- 6萬個細胞（5 ml測試管）或2萬個細胞（2 ml測試管）（均為稀釋平板法測定）。在 毒性測試儀上測出的初始發光量應在600-1 900 mV之間，低于600 mV允許將倍率調至“X2”檔，高 于1900 mV允許將倍率調至“X0. 5”檔。仍達不到標準者,更換凍干粉。

3.4L化鈉溶液,3g/100 mL

氧化鈉3 g于玻璃容器內，用量筒加蒸慵水100 ml。

3.5氧化鈉溶液,2g/100mL

氧化鈉2 g,加蒸儲水100 ml,于試劑瓶內，2?5C保存。

3.6參比毒物綠化汞標準溶液。

0. 02,0. 04,0. 06,0. 08,0.10,0.12,0.14,0. 16,0.18,0. 20,0. 22,0, 24 mg/L。

3.7 Y化汞母液,p=2 000 mg/L。

萬分之一分析天平精稱密封保存良好的無結晶水綠化汞0. 100 0 g入50 ml容量瓶，用3g/100 ml 氯化鈉溶液稀釋至刻度，置2?5C冰箱備用，保存期6個月。

國家*1995-03-25批準 "~1995-08-01實施

GB/T 15441-1995

3- 8Y化汞工作液,*=2 mg/L。

用移液管吸綠化汞2 000 mg/L母液10 ml入1 000 ml容量瓶，用3 g/100 ml氧化鈉溶液定容。再 用移液管吸取綠化汞20 mg/L液25 ml入250 ml容量瓶，用3 g/100 ml氧化鈉溶液定容，將此液倒入 ,配有半微量滴定管的試液瓶，然后，用3 g/100 ml氯化鈉溶液將疑化汞2 mg/L溶液按表1稀釋成系列 濃度（一律采用50 ml容量瓶）。這些Y化汞稀釋液保存期不超過24 h,超過者務必重配。

表1綠化汞工作溶液稀釋配制系列（在50 ml容量瓶中）

加綠化汞（2 mg/L）數,ml 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0

稀釋定容后綠化汞濃度,mg/L 0.02 0.04 0.06 0.08 0. 10 0.12 0.14 0.16 0.18 0.20 0.22 0.24

4儀8S

4.1生物發光光度計。

配置2或5 ml測試管。

當果;化汞標準溶液濃度為0.10 mg/L時，發光細菌的相對發光度為50%，其誤差不超過士 10% o

4.2 2 ml或5 ml測試樣品管（具標準磨口塞,為制造比色管的玻璃料制作，由專業玻璃儀器廠制造）， 分別適用于相應型號的生物發光光度計。

4.3微量注射器；10

4.4注射器：lml0

4.5定量加液瓶：5ml。

4.6 吸管：2、10、25mL

4 7試劑瓶:100 ml。

4.8 量筒：100、500 ml。

4.9 棕色容量瓶：50、250、1 000 ml。

4.10半微量滴定管（配磨口試液瓶,全套儀器均為棕色）:10 ml。

5樣品

5.1樣品的采集和保存

a.采樣瓶使用帶有聚四氯乙烯襯墊的玻璃瓶，務必清潔、干燥。采集水樣時，瓶內應充滿水樣不留 空氣。采樣后，用塑膠帶將瓶口密封。

b.毒性測定應在采樣后6 h內進行。否則應在2?5C下保存樣品，但不得超過24 h。報告中應寫 明水樣采集時間和測定時間。

c.對于含固體懸浮物的樣品須高心或過濾去除，以免干擾測定。

5.2樣品液的稀釋

5.2.1樣品液測定前稀釋的條件

5.2.1.1樣品液預試驗 取事先加瓠化鈉至3 g/100 ml濃度的樣品母液2 ml裝入樣品管，并設一支 CK管（氧化鈉3 g/100 ml溶液），按6所述測定相對發光度。

5.2.1.2按5.2.1.1測得的樣品，相對發光度低于50%乃至零，欲以EC”表達結果，則須稀釋。

5.2.13按5. 2.1.1測得的樣品,相對發光度在1%以上,欲以與相對發光度相當的疑化汞濃度表達 結果,則不須稀釋。

5.2.2樣品液的稀釋液

樣品液的稀釋液一律用蒸懈水，在定容前一律按構成氧化鈉3 g/100 ml濃度添加氯化鈉或濃溶液 （母液只能加固體）。

5.2.3樣品液稀釋濃度的選擇

GB/T 1 5441-1 995

5. 2.3.1探測試駛

按對數系列將樣品液稀釋成5個濃度：100%、10%、1%、。.1%、0.01%（它們的對數依次為。,一1， 一2, — 3, — 4）,按6所述粗測-遍視1%?100%相對發光度落在哪一濃度范圍。

5?2.3.2試驗

在1%?100%相對發光度所落在的濃度范圍內再增配6?9個濃度（例如，若落在0. 1%?10%之 間，則應稀釋成。.l%、0. 25%、0.5%、0. 75%、1%、2.5%、5%、7.5%、10%;若落在 1%?10%之間，則 應稀釋成1%、2%、4%、6%、8%、10%）,按6所述再測一遍;這6?9個濃度，也可通過查對數表，按等 對數間距原則自行確定（例如，若落在1%?10%之間，則應稀釋成10%、6. 31%、3. 98%、2. 51%, 1. 58%、1. 00%,它們的對數相應為 1. 00.0. 80,0. 60,0. 40.0. 20.0. 00,對數間距均為 0. 2）。

6測定

6-1測定條件

6.1.1室溫

室溫20?25C。

同一批樣品在測定過程中要求溫度波動不超過±「C °且所有測試器皿及試劑、溶液測前1 h均置 于控溫的測試室內。

6-1-2 pH

若須測定包括pH影響在內的急性毒性，不應調節水樣pH。

若須測定排除pH影響在內的急性毒性，須將水樣和CK（氯化鈉3 g/100 ml）pH測前調至下值:主 要含Cu水樣為4. 5,主要含其他金屬水樣為5. 4,主要含有機化合物水樣為7. 0。

6.1.3溶解氧

本法只能測定包括溶解氧影響在內的急性毒性。

6-2測定步驟

6.2.1試管的排列

于塑料或鐵制試管架上按以下二種情況排列測試管。

6.2.1.1按5. 2.1.3所述，樣品母液相對發光度為1%以上者，如下排列：

左側放參比毒物綠化汞系列濃度溶液管，右側放樣品管。前排放綠化汞溶液和樣品管，后一排放對 照（CK）管，后二排放CK預試驗管。每管綠化汞或樣品液均配一管CK（氧化鈉3 g/100 ml蒸饞水溶 液）。設3次重復。每測一批樣品，均須同時配置測定系列濃度綠化汞標準溶液。

表2試管在試管架上的排列

后二排 CK* CKg2

后一排 CK CK CK CK CK CK …CK CK CK CK CK CK CK …CK

前排 0.02 0.02 0.02 0.04 0.04 0.04 … 0.24 樣】棒1樣1祥2樣2祥2…樣”

管群 綠化汞（mg/L〉 樣 品

6. 2-1.2按5. 2.1. 2所述，樣品母液相對發光度為50%以下乃至零者，如下排列：

左側僅放Y化汞0. 10 mg/L溶液管（作為檢驗發光細菌活性是否正常的參考毒物濃度，它反應 15 min的相對發光度應在50%左右），右側放樣品稀釋液管（從低濃度到高濃度依次排列）。其他同 6. 2. L 1。每測一批樣品，均須同時配測綠化汞0. 10 mg/L溶液。

6.2-2加3 g/100 ml M化鈉溶液

用5 ml的定量加液瓶給每支CK管加2或5 ml兼化鈉3 g/100 ml（據儀器型號而定）。

6.2.3 加樣品液

GB/T 15441-1995

用2或5 ml吸管給每支樣品管加2或5 ml樣品液（據6.2.2而定）。每個樣品號換■支吸管。 6.2.4發光細菌凍干菌劑復蘇

從冰箱2?5 C室取出含有0.5 g發光細菌凍干粉的安甑瓶和氯化鈉溶液，投入置有冰塊的小號 （1?1. 5 L）保溫瓶，用1 ml注射器吸取0. 5 ml冷的氯化鈉2 g/100 ml（適用于5 ml測試管）或1 ml冷 的氯化鈉2. 5%（適用于2 ml測試管）注入已開口的凍干粉安甑瓶，務必充分混勻。2min后菌即復蘇圜 光（可在暗室內檢驗，肉眼應見微光）。備用。

6.2.5儀器的預熱和調零

打開生物發光光度計電源，預熱15 min,調零,備用。

6.2-6儀器檢驗復蘇發光細菌凍干粉質量

另取一空2或5 ml測試管，加2或5 ml氯化鈉3 g/100 ml（據6. 2. 2而定），加10』復蘇發光菌 液，蓋上瓶塞，用手斯倒5次以達均勻。拔去瓶塞,將該管放入各自型號儀器測試艙內，若發光量立即顯 示（或經過5?10 min上升到）60qfmV以上，此瓶凍干粉可用于測試，低于者按3.1. 4處理。菌液發光量 先緩慢上升,約持續5?15 min,后緩慢下降,約持續4 h。滿4 h的CK發光量應不低于400 mV,低于者 更換凍干粉。

6.2.7給各測試管加復蘇菌液

在發光菌液復蘇穩定（約半小時）后，按6. 2所述，從左到右,按綠化汞或樣品管（前）一CK管（后） 一綠化汞或樣品管（前）一CK管（后）……順序，用10貝微量注射器（勿用定量加液器以減少誤差）準確 吸取10 R復蘇菌液,逐一加入各管，蓋上瓶塞，用手顛倒5次，拔去瓶塞,放回原位（每管加菌液間隔時 間勿短于30 s°每管在加菌液的當時務必精確計時,記錄到秒，即為樣品與發光菌反應起始時間°立即將 此時間加殖重,記作各管反應終止（也即應該讀發光量）的時間。

6.2.8發光細菌與樣品反應達到終止時間的讀數

按各管原來加菌液的先后順序，當某管達到記錄的反應終止時間，在不加瓶塞的情況下，立即將測 試管放入儀器測試艙，讀出其發光量（以光信號轉化的電信號——電壓mV數表示）。

6.2.9有色樣品測定干擾的校正

a.拿掉儀器樣品船上的黑色塑料管口 ；

b.取一 2 ml測試管（直徑12 mm），加氯化鈉3 g/100 ml溶液2 ml,將該管放進一裝有少量氧化 鈉3 g/100 ml溶液的5 ml管（直徑20 mm）內，要使外管與內管的氯化鈉3 g/100 ml液面平齊。此作CK 管，

c.另取一 2 ml測試管，加氯化鈉3 g/100 ml溶液2 ml,放入另一裝有少量有色待測樣品液的 5 ml管內，要使外管與內管的氧化鈉3 g/100 ml液面平齊。此作CKc管*

d.于CK和CKc二管的內管中同時加復蘇發光菌液10 "1（注意:必須是本批樣品測定所用同一 瓶篡蘇菌液），立即記時到秒，等反應滿15 min,迅即放入儀器測試艙，測定二只帶有內管的5 ml測試管 的發光量。分別記下發光量京CK管）和乙2（CKc管）；

e.計算因顏色引起的發光量（mV）校正值

f.按6. 2.7和6. 2. 8所述常規步驟測試帶色樣品管及其CK管（氯化鈉3 g/100 ml溶液）的發光 量（mV）。所有CK管測得之發光#（mV）均須減去校正值乂（mV）后才能作為CK發光量（mV）。

GB/T 15441-1995

圖1有色樣品溶液測定干擾的校正

7測試結果的春達

7-1計算樣品相對發光度（％），并算出平均值。

相對發光度（%）=氧化噬碧齡寂時）x 100 （ 1）

相對發光度（％）平均值=（重復以^%）+（重復;）（％）+（重復3）（%）……（2）

7. 2符合5. 2.1.3條件者，建立并檢驗綠化汞濃度（C）與其相對發光度（『）％均值的相關方程,也可以 繪制關系曲線。

».求出一元一次線性回歸方程的a（截距）0（斜率、回歸系數）和「（相關系數），列出方程」

T ~ a-\- V■化秉  （ 3 ）

查相關系數顯著水平（P值）表，檢驗所求，值的顯著水平。若-W0. 01,且EG。皿秉=0. 10 ±0. 02mg/L,則所求相關方程成立;反之，不能成立，須重測系列甄化汞濃度的發光景.綠化汞溶液配 制過夜者，須重配后再測定。

b.也可以據建立的上述方程繪制關系曲線。即發光度為10%和90%，代入上式，求出相應的 二個林化汞濃度，在常數坐標紙上，定出二點，畫一直線,即為符合該方程的巍化汞濃度與相對發光度的 關系曲線。

7. 3符合5. 2.1. 2條件者，建立并檢驗樣品稀釋濃度（C）與其相對發光度（T）%均值的相關方程，繪制 關系曲線。

按7. 2所述方法建立相關方程T=a+6C樣，并檢驗相關系數r顯著水平（P值）。若P<0. 05,則所 求相關方程成立;反之，不能成立，須重測樣品稀釋系列濃度的發光量。

8根據測試結果表達樣品急性毒性

8.1用Y化汞濃度表達樣品毒性

8.1.1適用的條件

符合5.2.1. 3條件（樣品母液相對發光度大于1 %）并按7. 2建立了合格（PWO. Ol、EC5on化彖=0.10 士0. 02 mg/L）的Y化汞濃度與其相對發光度相關方程者。

8.1.2表達方法

GB/T 15441—1995

a.將測得的樣品相對發光度，代入7. 2的相關方程，求出與樣品急性毒性相當的氮化汞濃度（一 般用mg/L表示）；

b.測試結果報告同時列舉樣品相對發光度及其相當的綠化汞濃度值。 8.1.3適用性

適用于相對發光度在1%以上、特別是50%以上（即不可能出現EC、。值）但低于100%（即仍有中、 低水平毒性）的樣品毒性測定。

8.2用ECs。值表達樣品毒性

8.2.1適用的條件

符合5. 2.1. 2條件（樣品母液相對發光度低于50%乃至零）并按7.1建立了合格（P<0. 05）的樣品 稀釋液濃與其相對發光度相關方程者.

8.2.2表達方法

a.將T=50代入7. 3建立的相關方程，求出樣品的EG。值。這里的EC*值以樣品的稀釋濃度（一 般用百分濃度）表示；

b.測試結果報告列舉樣品的ECg值•

8.2.3適用性

適用于相對發光度在50%以下、特別是零（即毒性水平較高或很高）的樣品毒性測定，后者無法以 相當的Y化汞濃度表達毒性。

8.3測定記錄格式（見表3）

表3樣品急性毒性發光細菌測定法實驗記錄

測定日期 測定人 提取方式

L=a+bC, a= 6=

回歸方程 P<

GB/T 15441-1995

8.4測定結果報告內容

a.實驗室室溫；

b.采樣地點、日期、時間；

c.Y化汞濃度或樣品稀釋百分濃度與相對發光度的相關方程：

T = a + bC

『= 尸< ECS0«<t«= mg/L

d.樣品EC5。值（稀釋百分濃度）或相對發光度（%）及其相當的綠化汞濃度（mg/L）；

e.測定人及所在單位。

9方法的精密度    

附加說明：

本標準由國家*科技標準司提出，本標準由*南京土壤研究所負責起草。 本標準起草人顧宗濂、謝思琴、周德智、喬鴻澤。

本標準委托中國環境監測總站負責解釋。