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核酸雜交技術

來源:上海源葉生物科技有限公司   2011年07月23日 10:52  

核酸雜交技術是較早的應用于病原微生物的檢測技術。因其操作步驟比較煩瑣,現在在動物檢驗檢疫中應用較少,但是它是其他一些核酸檢測技術的基礎。它的基本步驟如下。
首先,制備一段寡核苷酸,其序列對應于被測病原微生物某段特異性核酸序列,在此寡核苷酸上進行適當的標記,作為檢測用探針。

然后,從樣品中提取核酸,對此核酸進行變性處理后固定在固相載體上,這些核酸變性處理后多數以單鏈的形式存在,因此它們能夠利用堿基互補原理,結合并固定探針,由于借助探針上標記的物質可以了解到是否有探針,甚至有多少探針被固定上去,再由此推知樣品中是否含有及甚至含有多少病原微生物。

上述是zui常用的固相雜交大致過程,除此之外還有液相雜交以及用于研究的細胞內定位(原位)雜交模式。新近發展的核酸芯片技術實際上也是一類核酸雜交技術。

就固相雜交而言,又可分為斑點雜交和凝膠電泳印跡轉移雜交。斑點雜交是直接將標本點在固相載體上雜交,該法迅速簡單,一次可檢測大量標本;凝膠電泳印跡轉移雜交是電泳技術和雜交技術結合的一種方法,根據雜交核酸的不同,又可分為Southern印跡法(檢測DNA)及Northern印跡法(檢測RNA)。傳統的固相載體多應用硝酸纖維膜和尼龍膜,近年來發展的微孔板包被技術以微孔板為載體取得了良好的效果。

探針標記物有放射性核素與非放射性物質兩種。放射性核素標記敏感性高,可檢測出pg水平的核酸,但因不易長期保存,且存在放射性污染等問題,現已較少應用。非放射性物質常用的有生物素、地高辛等,非放射性探針安全、穩定、操作方便并且經濟,但敏感性較低,近年來,由于雜交信號檢測方法的改進,檢測的敏感性得到了很大提高。

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