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反相高效液相色譜柱采用高壓輸液泵將規定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱，對供試品進行分離測定的色譜方法。注入的供試品，由流動相帶人色譜柱內，各組分在柱內被分離，并進入檢測器檢測，由積分儀或數據處理系統記錄和處理色譜信號。
反相高效液相色譜柱按溶質在兩相分離過程的物理化學原理分類：
(1)吸附色譜
用固體吸附劑作固定相，以不同極性溶劑作流動相，依據樣品中各組分在吸附劑上吸附性能的差別來實現分離。
(2)分配色譜
用載帶在固相基體上的固定液作固定相，以不同極性溶劑作流動相，依據樣品中各組分在固定液上分配性能的差別來實現分離。根據固定相和液體流動相相對極性的差別，又可分為正相分配色譜和反相分配色譜。
(3)離子色譜
用高效微粒離子交換劑作固定相，以具有一定pH值的緩沖溶液作流動相，依據離子型化合物中各離子組分與離子交換劑上表面帶電荷基團進行可逆性離子交換能力的差別而實現分離。
(4)體積排阻色譜
用化學惰性的多孔性凝膠作固定相，按固定相對樣品中各組分分子體積阻滯作用的差別來實現分離。
(5)親和色譜
以在不同基體上，鍵合多種不同特性的配位體作固定相，用具有不同pH值的緩沖溶液作流動相，依據生物分子(氨基酸、肽、蛋白質、核堿、核苷、核苷酸、核酸、酶等)與基體上鍵聯的配位體之間存在特異性親和作用能力的差別，而實現對具有生物活性的生物分子的分離。
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