WB是檢測蛋白質及蛋白質翻譯后修飾的經典方法，可在簡單或復雜的生物樣品中提供有關靶蛋白的半定量或定量數據，WB步驟復雜，

通常包括：蛋白樣本制備→電泳→轉膜→封閉→孵育一抗→孵育二抗→顯影→分析，

WB任何過程中出現的漏洞均可影響結果的靈敏度和重復性，必須注意將WB的每個步驟標準化，今天給大家分享WB各個過程中需要注意的細節！！！

按組織凈重(g)：裂解液體積(ml)=1：10的比例加入相應體積的裂解液(加入終濃度為1mM的PMSF、適當濃度的蛋白酶抑制劑和磷酸化酶抑制劑，以避免內源性酶分解蛋白，影響蛋白質的抽提)進行勻漿。

蛋白質的樣品制備是westemblotting的第一步，也是關鍵步驟，要想獲得所有蛋白質，應注意以下問題：

(1)在合適的鹽濃度下，應保持蛋白質的最大溶解性和可重復性；

(2)選擇合適的表面活性劑和還原劑，破壞所有非共價結合的蛋白質復合物和共價二硫鍵，使其形成各自多肽的溶液；

(3)盡量去除核酸，多糖，脂類等分子的干擾，在裂解完畢離心之后小心取中層澄清溶液，注意不要吸到底層沉淀和上層脂類；

(4)防止蛋白在處理過程中的人為修飾，制備過程必須在低溫下進行，以避免細胞破碎釋放出各種酶類的修飾。(注意：可以適當加入PMSF等酶抑制劑)

(5)樣本制備完后分裝保存，但是注意不要反復凍融。

30%的PAG配置完后過濾于4C保存，10% SDS室溫保存。AP不穩定，用時現配。（注意：分子量較小的蛋白選用較大濃度的凝膠）

制膠關鍵是聚合時間，分離膠聚合控制在從加入10% AP和TEMED至開始凝膠，時間為10-20min(未*凝聚)，濃縮膠最佳聚合時間為8-10min，可通過控制AP和TEMED量來控制。AP和TEMED的量過高，局部膠疑的太快，會使疑膠不均勻，電泳蛋白條帶會彎曲。環境溫度較高時，應減少AP和TEMED的量。空氣中氧氣也會影響膠的聚合，所以在分離膠上面應加一層水或正丁醇以隔絕氧氣。

(1)條帶出現微笑現象(中間凹兩邊翹起)：主要是凝膠中間部分凝固不均所致，應待凝膠充分凝固后電泳，或者催化劑加入后充分混勻；

(2)條帶出現“皺眉”現象(中間鼓坡兩邊向下)：兩玻璃板之間底部氣泡所致，應排除底部氣泡；

(3)帶出現拖尾現象：主要是樣本溶解效果不佳，分離膠濃度過大，電泳緩沖液放置時間過長。建議：加樣前離心，選擇適當的樣本緩沖液，加適量的樣品促溶劑；使用新配置的電泳緩中液，降低凝膠濃度或使用梯度凝膠。

(4)蛋白條帶出現紋理現象：樣品不溶性顆粒引起的。建議：加樣前離心，加入適量的促溶劑。

(5)指示的澳酚藍已跑出底板，但蛋白質未跑下來：與緩沖液和分離膠的濃度有關應更換正確PH值的緩沖液，降低凝膠濃度或使用梯度凝膠。

濕式電轉印注意事項：

(1)要使蛋白質組分能有效的從凝膠轉移到固相紙膜上，緩沖液的PH值很重要，有些分子量不是很大的蛋白質區帶，即使延長電轉印時間也不能從凝膠轉移到膜上。這是由于蛋白質在轉移緩沖液中恰好處于等電點狀態造成的，因此應適當改變轉移緩沖液的PH，以利于轉膜。另外，對于分子量較小的蛋白質，可在緩沖液中加入適量甲醇，因為甲醇能促進它們固定在固相膜上。但是對于大分子量的蛋白質，尤其是堿性蛋白質，緩沖液中是不宜加入甲醇的，因為甲使凝膠孔徑變小，不利于分子量較大的蛋白的轉移，甲醇能將結合在堿性蛋白質上的SDS解離出來而使其帶正電或呈電中性蛋白質就更難從凝膠中轉移出來；

(2)電轉印膜的選擇：有NC膜、重氮化膜和陽離子尼龍膜，PVDF膜。其中NC膜使用的最為普遍，它的蛋白質容量大，可用各種染色方法進行檢測，但是它與蛋白質的結合是非價性的，膜干燥后很脆。此外膜的孔徑大小也是考慮的重要因素，目的蛋白30KD以下用0.22 um孔徑的NC膜，30KD以上用0.45 um孔徑的NC膜；

(3)轉印選擇恒流，每個轉印槽150 mA，10KD以下轉印40min，10-30KD轉印50min，30-100KD轉印70min，100kd以上轉印80min，轉印完畢可用麗春紅S染膜檢測轉印是否成功，轉印結束后去除NC膜置于麗春紅S溶液中，室溫5-10min即可看見紅色條帶，用TBS洗數次即可洗掉紅色條帶進行后續實驗。

(1)電泳轉膜過后，膜上其他沒有結合蛋白質的空白位置需要用封閉液加以封閉，以避免一抗或二抗非特異性結合。這是由于WB的靈敏度很大程度上取決于封閉的好壞，封閉時間過長(過度封閉)導致抗原表位的遮蔽，從而降低檢測靈敏度，封閉時間過短(不*封閉)又會導致最終背景增高或信噪比太低，因此封閉液的選擇和條件的優化很重要；

(2)封閉液中應加入適量的防腐劑，避免封閉蛋白變性影響封閉效果。

(1)若非特異性條帶過多，可適當降低抗體的濃度，增加洗膜次數，蛋白電泳前延長變性時間，減少上樣蛋白量，延長封閉時間；

(2)若信號弱，可能轉膜不*，可優化轉移時間和電流，增加抗體的濃度，適當延長曝光時間；

(3 )若背景較高，可適當降低抗體的濃度，過濾二抗，延長封閉時間，增加漂洗時間，減少曝光時間。

(1)膠片曝光幾秒到數分鐘，具體情況要看膜上化學發光條帶明暗強度而定。膠片曝光時間不宜過長，時間過長會照成膠片背景變深。沖洗膠片以確定所測抗原的正確曝光時間；

(2)沖洗膠片的步驟：曝光完的膠片先在顯影液中沖洗至出現條帶為止，一般在1min以內，時間過長也會照成膠片背景變深。再放入定影液中漂洗，十秒即可顯影液漂洗完后，要多用清水沖洗，以免定影液中成分殘留在膠片上。