手機版
化工儀器網手機版
化工儀器網小程序
官方微信
公眾號：chem17
掃碼關注視頻號
作為 WB 的新手或老手，可能已經對 WB 實驗要點了然于胸，例如，需使用新鮮樣本，根據蛋白分子量選擇合適孔徑的轉印膜，根據抗體選擇適當的稀釋液，根據 ECL 液靈敏度調整二抗稀釋度等等。
但是，作為細節決定成敗的實驗，仍有幾個極易被忽視的細節和問題。
Q1：什么是 WB 陽性對照？β-actin 難道不是陽性對照嗎？
Q2：用什么裂解液裂解樣本？
Q3：WB 需要超聲嗎？
Q4：對于磷酸化蛋白，封閉需要用 BSA 嗎？
1）究竟什么是 WB 實驗的陽性對照？為什么要設立陽性對照？
陽性對照（Positive Control）是已知或*有目的蛋白表達的樣本。當對一個靶標并無檢測經驗時，在實驗初期，強烈建議增加陽性對照幫助排查一系列問題，例如，待測樣本中該靶標的表達量、操作步驟、抗體表現等。
而內參蛋白如 β-actin, GAPDH 等，一般在樣本中高表達，作為管家蛋白而用來對比不同樣本間的上樣量 (Loading Control)，并非目的蛋白的陽性對照。
與陽性對照相對應的，還有陰性對照，即不表達靶標蛋白的樣本。如圖 1 所示，利用使用抑制劑或生長因子處理，制備針對 p-AKT(Ser473) 的陰性或陽性對照。
圖 1：使用 Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb #4060（上）或 Akt (pan) (C67E7) Rabbit mAb #4691（下），對未經處理或經 LY294002/Wortmannin 處理的 PC-3 細胞、經血清饑餓或 PDGF 處理的 NIH/3T3 細胞提取物進行蛋白質印跡分析。
如何選擇陽性對照？
a. 總蛋白的陽性對照
選用明確表達該蛋白的細胞或組織樣本；可參考說明書示例圖或數據庫。如下圖所示，Saos-2 細胞高表達 RUNX2，適宜作為陽性對照樣本，而 LNCaP 細胞不表達該靶標。
圖 2：使用 RUNX2 (D1L7F) Rabbit mAb #12556 和 β-Actin (D6A8) Rabbit mAb #8457， 對 Saos-2 和 LNCaP 細胞的提取物進行蛋白質印跡分析。
b. 翻譯后修飾蛋白的陽性對照
并非所有的細胞都有基礎的翻譯后修飾水平（如磷酸化）的表達。如圖 3 所示，不同的細胞 p-AKT(Ser473) 的基礎水平差別非常大。有些靶標需要合適的刺激條件（包括誘導因子、劑量和時間窗）使蛋白獲得修飾。您可查看說明書、陽性對照處理表，或者通過廣泛閱讀文獻，了解處理方式，并結合預實驗摸索條件。
圖 3：使用 Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb 檢測不同樣本中靶標的表達。
2）裂解樣本用什么裂解液？
選擇裂解液的考慮因素為樣本種類：細胞，組織還是分離出的細胞組分。
對于全細胞裂解，建議使用 Cell Lysis Buffer（#9803）、RIPA 緩沖液（#9806）或 SDS 上樣緩沖液 (#7722)。Cell Lysis Buffer 由于不含會使蛋白變性的強力去垢劑，僅含 1%Triton，使其可在多種實驗中被使用（如 WB、IP）。RIPA 緩沖液含有 NP40 和脫氧膽酸鈉，變性能力更強，可以裂解細胞或者組織。SDS 上樣緩沖液也可以裂解細胞樣本，但會干擾后續的 BCA 測定。
使用裂解液裂解時，需提前加入蛋白酶抑制劑或磷酸酶抑制劑，以抑制內源性蛋白酶對細胞蛋白的降解和磷酸酶的去磷酸化作用。閱讀裂解液說明書，來明確是否需要額外添加蛋白酶抑制劑（PMSF #8553 或 Protease Inhibitor Cocktail #5871）或者磷酸酶抑制劑（Phosphatase Inhibitor Cocktail #5870）。對于 Cell Lysis Buffer（#9803）、RIPA 緩沖液（#9806），僅需補充 PMSF 即可。
對于細胞組分分離，則可以通過組分分離試劑盒完成。Cell Fractionation Kit #9038 可方便快速的分離細胞組分用于下游分析，通過移液和離心的方式，分步獲得細胞組分（圖 4）。
圖 4：使用 Cell Fractionation Kit #9038，對 HeLa 細胞的細胞組分進行蛋白質印跡分析，結果表明蛋白在細胞漿、細胞器/膜以及胞核/細胞骨架的定位。全細胞裂解物 (WCL) 表示總蛋白。細胞漿蛋白 (Cyto) 使用 CIB 緩沖液進行分離。膜和細胞器蛋白 (Mem) 使用 MIB 緩沖液進行分離。胞核和細胞骨架蛋白 (Nuc) 使用 CyNIB 緩沖液分離。
3）裂解后是否需要超聲？
樣本裂解后，建議進行超聲。超聲可以破壞膜結構，斷裂 DNA，降低樣本的粘稠度，讓樣本更加均質化，增加蛋白的溶解，提高實驗結果的一致性。對于核蛋白或者膜相關蛋白，超聲步驟尤為重要 (圖 5)。
超聲步驟為冰上 3 次 5 秒的超聲（50% 輸出功率），控制超聲探頭位置，避免產生氣泡。如沒有超聲儀，可用 1 mL 注射器針頭，冰上反復抽打裂解液 5~10 次，達到類似于超聲的效果。
圖 5：使用 Phospho-Histone H3 (Ser10) Antibody#9701 對超聲或者未經超聲處理的細胞裂解液進行檢測
4）封閉：BSA 還是奶粉？
封閉的目的是減少由一抗或二抗的非特異性結合引起的背景。BSA 僅含有一種蛋白質，分子量為 60KD。而奶粉則含有多種蛋白質，所以封閉作用更佳（圖 6）。
有文章指出奶粉中的磷酸酶可影響磷酸化信號，那磷酸化蛋白還能用牛奶嗎？我們的回答：是的。二十余年的磷酸化蛋白抗體研發經驗告訴我們，新鮮配置的牛奶不會對磷酸化信號產生任何影響，但隨著牛奶儲存時間的延長（即便在 4 ℃），就可能使磷酸化信號下降。且牛奶封閉更加全面，使得磷酸化靶標識別特異性更佳。
圖 6：使用 Phospho-Akt (Thr308) (D25E6) XP® Rabbit mAb #13038，檢測經 PDGF 處理的 3T3 細胞樣本，BSA 封閉的結果中可見背景和雜帶，而牛奶封閉的結果背景更干凈，信號強且清晰。
封閉時使用 5% 脫脂奶粉-TBST，搖床上室溫封閉 1 h。如后續使用熒光發光法，則封閉時不可含有 Tween® 20。二抗孵育時，也推薦用 5% 脫脂奶粉-TBST 稀釋二抗，降低背景。注意，需使用實驗級脫脂奶粉（Nonfat Dry Milk #9999），食品級奶粉不可用于實驗。
免責聲明
- 凡本網注明“來源：化工儀器網”的所有作品，均為浙江興旺寶明通網絡有限公司-化工儀器網合法擁有版權或有權使用的作品，未經本網授權不得轉載、摘編或利用其它方式使用上述作品。已經本網授權使用作品的，應在授權范圍內使用，并注明“來源：化工儀器網”。違反上述聲明者，本網將追究其相關法律責任。
- 本網轉載并注明自其他來源（非化工儀器網）的作品，目的在于傳遞更多信息，并不代表本網贊同其觀點和對其真實性負責，不承擔此類作品侵權行為的直接責任及連帶責任。其他媒體、網站或個人從本網轉載時，必須保留本網注明的作品第一來源，并自負版權等法律責任。
- 如涉及作品內容、版權等問題，請在作品發表之日起一周內與本網聯系，否則視為放棄相關權利。
采購中心