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中藥材中黃曲霉毒素檢測解決方案

來源：無錫冠一生物科技有限公司 2023年02月06日 14:44

致分析工作者

隨著國家對生物毒素類污染殘留的監管力度加大，各級實驗室都面臨著盡快建立切實可行的檢測方法，在此就2020版藥典《中國藥典》編寫了《中藥材中黃曲霉毒素分析方法解決方案》，供中藥材檢測實驗室人員參考查詢。

目錄

一、 2020版藥典2351黃曲霉毒素測定法

二、 2020版藥典相比2015版藥典檢測黃曲霉方法變化解讀

三、 SN/T 4604-2016進出口中藥材中真菌毒素的測定（節選）

四、復雜中藥材樣品測定解決方案

五、 Auto IPS-6060 全自動免疫親和操作儀應用于藥典中黃曲霉毒素測定

六、中藥材黃曲霉毒素測定采購指南

七、中藥材黃曲霉毒素測定常見問題舉例

一、2020版藥典2351黃曲霉毒素測定法

第一法 液相色譜法

本法系用高效液相色譜法（通則0512）測定藥材、飲片及制劑中的黃曲霉毒素（以黃曲霉毒素B₁、黃曲霉毒素B₂、黃曲霉毒素G₁、黃曲霉毒素G₂總量計），除另有規定外，按下列方法測定。

（一）色譜條件與系統適用性試驗

1. 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑

2. 流動相：甲醇-乙腈-水（40:18:42）

3. 采用柱后衍生器檢測

4. ①碘衍生法：衍生溶液為0.05%的溶液(取0.5g，加入甲醇100mL溶解，用水稀釋至1000mL制成），衍生化泵流速0.3mL/min，衍生化溫度70℃；②光化學柱后衍生器（254nm.PriboFast-KRC光化學柱后衍生器.）

5. 熒光檢測器檢測，激發波長：360nm(365nm) 發射波長：450nm

6. 兩個相鄰色譜峰的分離度應大于1.5。

（二）混合對照品溶液的制備

精密量取黃曲霉毒素混合對照品溶液（黃曲霉毒素B₁、黃曲霉毒素B₂、黃曲霉毒素G₁、黃曲霉毒素G₂標示濃度分別為1.0µg/mL、0.3µg/ mL、1.0µg/ mL、0.3µg/ mL）0.5 mL,置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，作為儲備溶液。精密量取儲備溶液1 mL，置25 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得。

（三）供試品溶液的制備

1. 取供試品粉末約15g(過二號篩)，精密稱定，加入氯化鈉3g，置于均質瓶中，精密加入70%甲醇溶液75mL，高速攪拌2min（攪拌速度大于11,000 r/min, 轉速22,000 r/min）。

2. 4000r/min離心5分鐘。

3. 精密量取上清液15mL，置50mL量瓶中，用水（專用淋洗緩沖液）稀釋至刻度，搖勻，離心10分鐘（離心速度4000r/min）

4. 準確移取20.0mL樣品提取液，過免疫親和柱，過柱時流速不能快，流速快的話回收效率差，建議采取重力過柱。

5. 用水20mL洗脫（必要時可先用淋洗緩沖液10mL淋洗，再用10mL水淋洗），洗滌液棄去。

6. 為保證洗脫充分，建議以2.0mL色譜甲醇分三步進行洗脫，重力洗脫即可。首先，加入1.0mL甲醇洗脫，當溶劑通過柱子后，孵育30s（孵育即甲醇在柱子中浸泡）；然后，再加入0.5mL甲醇進行洗脫，過柱前孵育30s；最后，再加入0.5mL甲醇洗脫，過柱前孵育30s，并使2-3mL空氣通過柱體，收集洗脫液，置2mL量瓶中，并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。(免疫親和柱操作建議使用泵流操作架,便于控制各個步驟流速,保證較好的回收率)

7. 測定法：分別精密吸取上述混合對照品溶液5μL、10μL、15μL、20μL、25μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，以峰面積為縱坐標，進樣量為橫坐標，繪制標準曲線。另精密吸取上述供試品溶液20～25μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，從標準曲線上讀出供試品中相當于黃曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂的量，計算，即得。

第二法 液相色譜-串聯質譜法

本法系用高效液相色譜-串聯質譜法測定藥材、飲片及制劑中的黃曲霉毒素（以黃曲霉毒素B₁、黃曲霉毒素B₂、黃曲霉毒素G₁、黃曲霉毒素G₂總量計），除另有規定外，按下列方法測定。

（一）色譜、質譜條件與系統適用性試驗

以十八烷基硅烷鍵硅膠填充劑；以10mmol/L醋酸銨溶液為流動相A，以甲醇為流動相B；柱溫25℃；流速0.3mL/min；按下表中的規定進行梯度洗脫。

以三重四極桿串聯質譜檢測；噴霧離子源ESI)，采集模式為離子模式；各化合物監測離子對和撞壓(CE)見下表。

（二）系列混合對照品溶液的制備

精密量取黃曲霉毒素混對照品溶液（黃曲霉毒素B₁、黃曲霉毒素B₂、黃曲霉毒素G₁、黃曲霉毒素G₂標示濃度分別為1.0µg/mL、0.3µg/mL、1.0µg/mL、0.3µg/mL）適量，用70%甲醇稀釋成含黃曲霉毒素B₂、G₂濃度為0.04?3ng/mL，黃曲霉毒素B₁、G₁濃度為0.12?l0ng/mL的系列對照品溶液，即得（必要時根據樣品實際情況，制系列基質對照品溶液）

（三）供試品溶液的制備同第一法

測定法精密吸取上述系列對照品溶液各5μL,注入高效液相色譜-質譜，測定峰面積，以峰面積縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準。另精密吸取上述供試品溶液5μL，注入高效液相色譜-串聯質譜，從標準曲線上讀出供試品中相當于黃曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂的量，計算，即得。

第三法 酶聯免疫法

本法系用高效液相色譜-串聯質譜法測定藥材、飲片及制劑中的黃曲霉毒素（以黃曲霉毒素B₁，或黃曲霉毒素B₁、黃曲霉毒素B₂、黃曲霉毒素G₁、黃曲霉毒素G₂總量計），除另有規定外，按下列方法測定。

（一）標準品溶液的制備

精密量取 PriboFast^®STD#1041黃曲霉毒素B₁標準品溶液，PriboFast^®STD#1082AFT黃曲霉毒素混合標準品溶液用硫酸鹽緩沖液稀釋成每1L含0 µg、0.05 µg、0.15 µg、0.45 µg、1.35 µg（測定黃曲霉毒素B₁）或0 µg、0.025 µg、0.075 µg、0.225 µg、0.675 µg（測定黃曲霉毒素總量）的系列標準品溶液，即得。

（二）供試品溶液的制備

1. 供試品粉末2.0g至50mL離心管中，20mL甲醇振蕩5min，離心5min（3000r/min）。

2. 取2mL上清液至10mL干凈離心管中，50-60℃水浴氮氣流下吹干。

3. 加入2mL去離子水振動30秒，加入6mL 振蕩2min，離心5min（3000r/min）。

4. 取下層液3-10mL于離心管中，置氮吹儀于50-60℃水浴濃縮至干，加入1mL正己烷渦旋30秒，再加入2mL磷酸鹽緩沖液渦旋1min，離心5min（3000r/min），取下層液，即得。

（三）測定法

黃曲霉毒素B₁和黃曲霉毒素總量的測定：分別采用合適濃度的抗體包被微孔板孔，經封閉、干燥等處理后加入系列標準品溶液，再加入經酶標抗原稀釋液稀釋至合適工作濃度的酶標抗原，混勻，于25℃反應45min，用洗滌工作液洗滌，每孔加入底物顯色液100μL，于25℃反應15min，每孔加入終止液50μL，采用酶標儀于450nm處，參比波長630nm，測定每孔吸光度值。

注：

（1）測定前，可選擇陰性樣本進行添加回收試驗，樣本回收率應在60%-120%。

（2）線性回歸的相關系數應不低于0.990。

（3）供試品溶液百分吸光率超出標準曲線范圍時，須對已制備好的供試品溶液進行稀釋，使其百分吸光率落入曲線范圍后再檢測。

（4）當測定結果超出限度時，采用第二法進行確認。

【附注】

1. 本實驗應有相應的安全、防護措施，并不得污染環境。

2. 殘留有黃曲霉毒素的廢液或廢渣的玻璃器皿，應置于專用貯存容器（裝有10%次氯酸鈉溶液）內，浸泡24小時以上，再用清水將玻璃器皿沖洗干凈。

二、2020版藥典相比2015版藥典檢測黃曲霉方法變化解讀

三、SN/T 4604-2016 進出口中藥材中真菌毒素的測定（節選）

1. 范圍

本標準規定了進出口中藥材中黃曲霉毒素B_1、B_2、G_1、G_2、M_1、M₂，赭曲霉素A，伏馬毒素B_1、B₂，T-2毒素，HT-2毒素，二羥基苯甲酸內脂類真菌毒素的液相色譜-質譜/質譜檢測方法。

本標準適用于進出口當歸、桔梗五味子、枸杞、大青葉、金銀花、地龍中黃曲霉B_1、B_2、G_1、G_2、M_1、M₂，赭曲霉素A，伏馬毒素B_1、B₂，T-2毒素，HT-2毒素，二羥基苯甲酸內脂類真菌毒素的液相色譜-質譜/質譜檢測方法。

2. 分析步驟

(1) 提取

稱取5g試樣(精確到0.01g)置于50 mL具塞塑料離心管中，加人1g氧化鈉，再加人PBS溶液25 mL，均質提取2 min，5000 r/min離心10 min，將全部上清液用玻璃纖維濾紙過濾后得提取液A；向殘渣中加人25 mL甲醇，均質提取2 min，5000 r/min離心10 min，取上清液10 mL，用PBS稀釋至100 mL，用玻璃纖維濾紙過濾后得到提取液B。

(2) 免疫親和柱凈化

稱取5g試樣(精確到0.01g)置于50 mL具塞塑料離心管中，加人1g氧化鈉，再加人PBS溶液25 mL，均質提取2 min，5 000 r/min離心10 min，將全部上清液用玻璃纖維濾紙過濾后得提取液A；向殘渣中加人25 mL甲醇，均質提取2 min，5000 r/min離心10 min，取上清液10 mL，用PBS稀釋至100 mL，用玻璃纖維濾紙過濾后得到提取液B。

將免疫親和柱連接于10 mL玻璃針筒下,將50 mL提取液B全部通過免疫親和柱(PriboFast^®復合免疫親和柱)(流速控制在1滴/s~2滴/s)然后用10 mL含0.1%吐溫的PBS淋洗親和柱，再將5mL提取液A通過免疫親和柱（流速控制在1~2滴/S）。待提取液全部通過親和柱，用5mL含0.1%吐溫的PBS和20mL水淋洗親和柱，直至空氣進入親和柱，棄去全部流出液；用2 mL甲醇淋洗親和柱(流速控制在1滴/S)，當甲醇大部分過柱時，停止加壓，靜置孵育5 min，再用2 mL甲醇淋洗親和柱(流速控制在1滴/S)，收集全部淋洗液；將淋洗液置于40℃下水浴氮氣吹干，用1 mL甲醇-2 mmol/L乙酸銨溶液(含0.1%甲酸)(40：60體積比)溶解殘渣，過0.22 μm有機系濾膜，用液相色譜-質譜/質譜測定。

四、復雜中藥材樣品測定解決方案

針對目前藥典方法檢測中藥材中黃曲霉毒素過程中出現的決明子、遠志、檳郎等個別樣品基質復雜，凈化效果差，譜圖中雜質峰過多的問題，普瑞邦技術中心制定了一套針對中藥材前處理的解決方案。應用此解決方案進行樣品前處理，經高效液相色譜柱后光化學衍生進行檢測可達到較好的凈化效果，雜峰明顯減少，使分析結果更加準確。供廣大同行老師參考：

圖1 方法優化后（左）與優化前（右）遠志樣品過柱對比

圖2 方法優化后遠志樣品加標與標準品疊加對比

圖3 方法優化前遠志樣品加標與標準品疊加對比

五、Auto IPS-6060 全自動免疫親和操作儀應用于藥典中黃曲霉毒素測定

通過Auto IPS-6060 全自動免疫親和操作儀在2015版藥典中檢測黃曲霉的案例，對比手工的精密度和回收率。全自動免疫親和操作儀不但在具體的方法操作和技術運用上更加先進，而且在整個分析過程中都有非常嚴格的質量控制和質量保證，確保分析結果準確，排除人為操作造成的實驗誤差。

黃曲霉毒素B、G混標

表1：精密度與回收率比對表

序號	手動			IPS
序號	結果μg/kg	回收率%	精密度%	結果μg/kg	回收率%	精密度%
1（遠志樣品）	ND	——	——	ND	——	——
2（遠志加標）	7.03	70.3	11.1	7.74	77.4	5.7
3（遠志加標）	8.71	87.1		8.66	86.6
4（遠志加標）	7.53	75.3		8.05	80.5

*注：上表采用遠志樣品，按照10μg/kg進行添加。

表2：成本及操作比對表

對比	時間成本	操作
手動	2h	復雜
IPS	1h	簡單
IPS優勢	節省1h	簡單、一致性好

*注：上表按照4支柱子進行對比。

Auto IPS-6060 全自動免疫親和操作儀在進行過免疫親和柱實驗中得到了優于手動過柱的結果，通過比對不難發現，Auto IPS-6060 全自動免疫親和操作儀在回收率和精密度方面有所提高，大大節省了人力以及時間成本，同時也縮短了實驗人員接觸試劑的時間，保證了實驗人員的安全。

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