細菌呼吸鏈復合物II活性比色法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

 細菌呼吸鏈復合物II（琥珀酸－輔酶Q還原酶）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在使用合成輔酶Q同功類似物二氯酚靛酚，通過反應系統測定樣品中二氯酚靛酚還原后吸光峰值的變化，即采用比色法測定樣品中酶活性的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種野生、培養或病原性細菌膜蛋白懸液樣品的琥珀酸－輔酶Q還原酶的特異性活性檢測。產品不含污染性蛋白酶，嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，反應優化，檢測敏感。

技術背景

細菌呼吸鏈復合物II，通常稱為琥珀酸－輔酶Q還原酶或琥珀酸脫氫酶（Succinate-Coenzyme Q Oxidoreductase；Succinate Dehydrogenase；SQR），結構和功能上類同于線粒體復合物II，膜結合型，是細菌需氧呼吸鏈與三羧酸循環鏈接的主要元素：含有四個亞體，鐵硫中心（Fe-S clusters），輔因子為黃素（flavin）。其最特征性的酶活性是噻吩甲酰三氟丙酮（thenoyltrifluoroacetone；TTFA）敏感的琥珀酸－輔酶Q還原酶。復合物II催化琥珀酸（succinate）被氧化為富馬酸（fumarate），細菌內電子由供體黃素傳遞到內膜上輔酶Q受體（泛醌；ubiquinone）的能量轉移反應，進行呼吸鏈傳遞。基于琥珀酸底物，通過琥珀酸－輔酶Q還原酶的催化，氧化為富馬酸，同時氧化型二氯酚靛酚（dichlorophenal-indophenol；DCPIP）轉化為還原型二氯酚靛酚（dichlorophenal-indophenol；DCPIPH2），在分光光度儀下產生吸光峰值的變化（600nm 波長），由此定量測定琥珀酸－輔酶Q還原酶的特異活性。其反應系統是：

Complex II

SUCCINATE  +  DCPIP  +  CoQ       →      FUMARATE  +  DCPIPH2  +  CoQH2

藍色            無色

↑Abs 600 nm           ↓Abs 600 nm

產品內容

 緩沖液（Reagent A）         20毫升

 反應液（Reagent B）         2.5毫升

 陰性液（Reagent C）            2毫升

 底物液（Reagent D）         500微升

產品說明書                1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免反復凍融； 反應液（Reagent B）和 底物液（Reagent D），避免光照，有效保證6月

用戶自備

比色皿：用于比色的容器

分光光度儀：用于比色分析

培養箱：用于孵育反應物

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化； 緩沖液（Reagent A）室溫預熱； 反應液（Reagent B）和 底物液（Reagent D）注意避光。然后進行下列操作。

一、 測定準備

1． 準備好待測樣品（例如細菌膜蛋白樣品等），置于冰槽里 

2． 設定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長為600nm，間隔60秒，讀數6次（共5分鐘），并置零

二、 背景對照測定

1． 移取780微升 緩沖液（Reagent A）到新的比色皿

2． 加入100微升 反應液（Reagent B）

3． 加入20微升 底物液（Reagent D）

4． 上下傾倒數次，混勻

5． 放進30℃培養箱里靜置3分鐘

6． 加入100微升 陰性液（Reagent C）

7． 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）

8． 即刻放入分光光度儀檢測，此為背景空對照：600波長讀數0分鐘－600波長讀數1分鐘或5分鐘 

三、 樣品活性測定

1． 移取780微升 緩沖液（Reagent A）到新的比色皿

2． 加入100微升 反應液（Reagent B）

3． 加入20微升 底物液（Reagent D）

4． 上下傾倒數次，混勻

5． 放進30℃培養箱里靜置3分鐘

6． 加入100微升待測樣品（注意：50微克細菌膜蛋白）

7． 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）

8． 即刻放入分光光度儀檢測，此為樣品活性讀數：600波長讀數0分鐘－600波長讀數1分鐘或5分鐘

四、 計算樣品活性

【（樣品讀數－背景讀數）X 1（體系容量；毫升）X樣品稀釋倍數】÷【0.1（樣品容量；毫升）X 21.8（毫摩爾吸光系數 X 1或5（反應時間；分鐘）】＝單位/毫升÷（樣品蛋白濃度）毫克/毫升＝單位/毫克

單位＝微摩爾二氯酚靛酚/分鐘

注意事項

1． 本產品為21次操作，包括背景對照

2． 操作時，須戴手套

3．  反應液（Reagent B）含有毒性物質，避免直接用手接觸

4． 系統操作過程中，背景測定只需1次

5． 如果增強酶活檢測，建議使用細菌膜蛋白樣品。推薦 線粒體復合物待測樣品預處理試劑盒－GMS10342

6． 加入樣品啟動反應后3秒內即刻比色測定

7． 96孔板測定初始讀數（0分鐘讀數）0.5左右為理想狀態；比色皿測定為1.0左右

8． 反應1分鐘后比色測定值趨于穩定；測定值由高到低變化；測定可以持續5分鐘

9． 測定值由高到低變化，即5分鐘測定讀數低于0分鐘測定讀數，表明有酶活性

10． 比色測定后，比色皿須清洗

11． 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/100微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量；注意計算公式的調整

12． 呼吸鏈復合物II（琥珀酸－輔酶Q還原酶）單位活性定義為：在30℃，pH 7.5條件下，每分鐘內能夠還原1微摩爾合成輔酶Q同功類似物二氯酚靛酚（DCPIP）所需的酶量作為一個活性單位

13． 本公司提供系列細菌酶類技術產品

質量標準

1． 本產品經鑒定性能穩定

2． 本產品經鑒定檢測準確