細菌呼吸鏈復合物II活性比色法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

  細菌呼吸鏈復合物II（琥珀酸－輔酶Q還原酶）活性比色法定量檢測試劑是一種旨在使用合成輔酶Q同功類似物二氯酚靛酚，通過反應系統(tǒng)測定樣品中二氯酚靛酚還原后吸光峰值的變化，即采用比色法測定樣品中酶活性的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種野生、培養(yǎng)或病原性細菌膜蛋白懸液樣品的琥珀酸－輔酶Q還原酶的特異性活性檢測。產品不含污染性蛋白酶，嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，反應優(yōu)化，檢測敏感。

技術背景

細菌呼吸鏈復合物II，通常稱為琥珀酸－輔酶Q還原酶或琥珀酸脫氫酶（Succinate-Coenzyme Q Oxidoreductase；Succinate Dehydrogenase；SQR），結構和功能上類同于線粒體復合物II，膜結合型，是細菌需氧呼吸鏈與三羧酸循環(huán)鏈接的主要元素：含有四個亞體，鐵硫中心（Fe-S clusters），輔因子為黃素（flavin）。其最特征性的酶活性是噻吩甲酰三氟丙酮（thenoyltrifluoroacetone；TTFA）敏感的琥珀酸－輔酶Q還原酶。復合物II催化琥珀酸（succinate）被氧化為富馬酸（fumarate），細菌內電子由供體黃素傳遞到內膜上輔酶Q受體（泛醌；ubiquinone）的能量轉移反應，進行呼吸鏈傳遞。基于琥珀酸底物，通過琥珀酸－輔酶Q還原酶的催化，氧化為富馬酸，同時氧化型二氯酚靛酚（dichlorophenal-indophenol；DCPIP）轉化為還原型二氯酚靛酚（dichlorophenal-indophenol；DCPIPH2），在分光光度儀下產生吸光峰值的變化（600nm 波長），由此定量測定琥珀酸－輔酶Q還原酶的特異活性。其反應系統(tǒng)是：

產品內容

  緩沖液（Reagent A）         毫升

  反應液（Reagent B）         毫升

  陰性液（Reagent C）           毫升

  底物液（Reagent D）          微升

產品說明書               1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免反復凍融；  反應液（Reagent B）和  底物液（Reagent D），避免光照，有效保證6月

用戶自備

比色皿：用于比色的容器

分光光度儀：用于比色分析

培養(yǎng)箱：用于孵育反應物

實驗步驟

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化；  緩沖液（Reagent A）室溫預熱；  反應液（Reagent B）和  底物液（Reagent D）注意避光。然后進行下列操作。

一、 測定準備

1． 準備好待測樣品（例如細菌膜蛋白樣品等），置于冰槽里 

2． 設定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長為600nm，間隔60秒，讀數6次（共5分鐘），并置零

二、 背景對照測定

1． 移取xx微升  緩沖液（Reagent A）到新的比色皿

2． 加入xx微升  反應液（Reagent B）

3． 加入xx微升  底物液（Reagent D）

4． 上下傾倒數次，混勻

5． 放進30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘

6． 加入xx微升  陰性液（Reagent C）

7． 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）

8． 即刻放入分光光度儀檢測，此為背景空對照：600波長讀數0分鐘－600波長讀數1分鐘或5分鐘 

三、 樣品活性測定

1． 移取xx微升  緩沖液（Reagent A）到新的比色皿

2． 加入xx微升  反應液（Reagent B）

3． 加入xx微升  底物液（Reagent D）

4． 上下傾倒數次，混勻

5． 放進30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘

6． 加入100微升待測樣品（注意：50微克細菌膜蛋白）

7． 上下傾倒數次，混勻（限定在3秒之內）

8． 即刻放入分光光度儀檢測，此為樣品活性讀數：600波長讀數0分鐘－600波長讀數1分鐘或5分鐘

四、 計算樣品活性

注意事項

1． 本產品為21次操作，包括背景對照

2． 操作時，須戴手套

3．   反應液（Reagent B）含有毒性物質，避免直接用手接觸

4． 系統(tǒng)操作過程中，背景測定只需1次

5． 如果增強酶活檢測，建議使用細菌膜蛋白樣品。推薦  線粒體復合物待測樣品預處理試劑盒－10342

6． 加入樣品啟動反應后3秒內即刻比色測定

7． 96孔板測定初始讀數（0分鐘讀數）0.5左右為理想狀態(tài)；比色皿測定為1.0左右

8． 反應1分鐘后比色測定值趨于穩(wěn)定；測定值由高到低變化；測定可以持續(xù)5分鐘

9． 測定值由高到低變化，即5分鐘測定讀數低于0分鐘測定讀數，表明有酶活性

10． 比色測定后，比色皿須清洗

11． 建議待測樣本蛋白濃度為50微克/100微升；如果樣本酶活性過低或過高，則可以增加或降低樣本量；注意計算公式的調整

12． 呼吸鏈復合物II（琥珀酸－輔酶Q還原酶）單位活性定義為：在30℃，pH 7.5條件下，每分鐘內能夠還原1微摩爾合成輔酶Q同功類似物二氯酚靛酚（DCPIP）所需的酶量作為一個活性單位

13． 本公司提供系列細菌酶類技術產品

質量標準

1． 本產品經鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產品經鑒定檢測準確