說到親和層析，還得從上個世紀60年代說起。當年美國NIH（National Institutes of Health）有個學生在研究一種酶和抑制劑之間的相互作用的時候，突發奇想：既然此酶可以和抑制劑結合，那如果把抑制劑固定起來，不就可以用來純化酶了嗎？試了一下覺得果然可行于是發了一Paper，從那之后，就出現了各種各樣的親和層析，親和配基與配體可以是酶與底物、酶與抑制劑、激素與受體、抗原和抗體、糖蛋白與凝集素、生物素與親和素、組氨酸與二價金屬離子、卟啉環與亞鐵離子等。親和層析精髓：將一種分子固定，用來吸附另一種特異性分子，zui后將其洗脫下來。

言規正傳，多抗的親和層析是基于抗原與抗體結合的一種層析方式。基本思路是將抗原固定在一種基質（也就是柱的填料，大家都叫beads）上，然后與抗血清孵育以捕獲相應的抗體，然后從基質上洗掉非特異性結合的抗體，zui后再將抗體洗脫下來。一個經典的親和純化流程如下：

1、介質的制備。目前大部分親和柱介質都是基于瓊脂糖（Agarose）或者葡聚糖（Dextran）。由于瓊脂糖穩定性好、對蛋白質的非特異性吸附低、適宜活化，因此是制備抗原親和柱填料的理想材料。單純的瓊脂糖是不能和蛋白質直接相連的，因此需要給它加一個有活性的臂，這就有點類似多肽與載體蛋白的偶聯需要一個雙功能試劑一樣。瓊脂糖加臂（活化）的方法比較多，其中涉及的原理也和多肽與載體蛋白偶聯類似，zui常用的活化試劑是溴化氰和環氧氯丙烷，另外二溴丙醇、N,N'-羰基二咪唑、雙環氧化物等也可以用來活化瓊脂糖。

溴化氰對瓊脂糖的活化機理如下：

環氧氯丙烷活化機理如下：

關于如何操作的問題，可以參考文獻，也可以在本站論壇和大家交流（等本站完成，站長將會陸續上傳文獻至論壇）。如果你想自己制備，為了你和他人的安全，請不要使用溴化氰活化，溴化氰有劇毒，極微量的攝入都有可能造成死亡，本站對此類事故不負任何責任。如果是單純做一次或幾次小量抗原親和純化，建議購買商品化的填料，GE Healthcare就有賣的（Cat. NO.為17-0430-01）。 以下的介紹就基于此填料說明書展開敘述的。使用此種填料首先需要將其進行預處理，預處理方法是：稱取適量的beads（一般0.5g beads可以一次性純化10ml左右血清，可以反復使用）倒入pH 2.0 HCl中，四度讓其吸脹15min，體積膨脹比例為：1g可以膨脹至3.5ml，然后將其裝入漏斗中，用pH2.0 HCl充分洗滌（體積為beads膨脹后的50倍以上）以除去保護劑。千萬不可用中性或堿性試劑洗滌，否則beads會水解。

2、抗原與填料的連接 這一步是整個純化過程中zui關鍵的一步，如果在這一步上有什么失誤，建議你從step one重新開始吧。 首先要注意一點：常見的連接方法都基于抗原上的游離氨基或者巰基與活化后的beads的連接，因此體系中不應該有其它含有氨基或巰基的化合物，包括尿素、硫脲、鹽酸胍、Tris、銨根離子、Beta-巰基乙醇等，如果有這些物質在體系中，應該首先設法除去。

溴化氰活化的瓊脂糖與氨基化合物反應的機理如下：

環氧氯丙烷活化的瓊脂糖與氨基化合物反應的機理如下：

連接反應進行的條件：（1）Buffer體系。上述兩個連接反應都應該在堿性環境下進行。pH宜在8-10之間，推薦使用Na₂CO₃-NaHCO₃體系,pH盡量偏離蛋白的等電點，但不可高于10，否則填料很容易水解。pH也不能過低，否則抗原的氨基或巰基會被質子化，無法與beads結合。也可以考慮用其它的緩沖體系，但是不可引入帶有游離氨基或者巰基的化合物。為了防止蛋白類抗原的聚集，體系中還可以加入0.5M NaCl以提高鹽離子濃度。（2）蛋白質濃度。為了達到比較快而且比較*的反應，抗原濃度應盡量提高（也就是高中課本上講的勒沙特列原理），但過高的濃度有可能造成聚集形成沉淀。一般推薦濃度是5-10mg/ml。需要注意的是beads的承載量并沒有這么大。用來連接的蛋白在buffer體系中必須*溶解，如果不能溶解可以嘗試加入去垢劑，多肽等小分子化合物可以用DMSO、DMF、二氧六環助溶。（3）反應溫度與時間。此反應可以在室溫進行，一般來說，室溫4小時反應足夠完成，如果擔心抗原降解，可以在4℃進行，需要過夜反應。

3、連接效果的評估 有經驗的同仁這一步基本可以不做，但是對于新手來說做了這一步心里更有譜一些。這個過程盡量用比較簡單的實驗來做比較好，推薦使用考馬斯亮藍法（Bradford法），但是體系中如果含有去垢劑，建議改用其它的方法（如BCA，Lowery、凱氏定氮法等），也可以取連接后的上清液（離心后）拿去做SDS-PAGE判斷。確認連接沒有問題后，以將體系轉入柱子里除去連接后的液體，如果沒有柱子，也可以用離心的方法進行，下同。

4、多余位點的封閉 為了保證連接效率，beads的量通常是過量的，因此連接完后，beads上就有很多多余的空位點，如果不把它們封閉，那接下來的一步里就會與血清中的抗體結合，這樣就會影響抗體得率。 含有氨基的小分子化合物都可以用來進行封閉，如尿素、Tris、乙醇氨、單一氨基酸，大分子物質是不適宜用來封閉的，因為它們的空間位阻會影響下一步中抗體與抗原的結合。封閉條件與連接條件基本類似。封閉完成后，除去封閉液，用PBS洗柱三次。

5、抗血清與beads的結合 血清事先經過10000g 離心5min，有條件的還可以通過0.45um濾膜過濾。將血清用PBS稀釋一倍，然后加入連好抗原的beads，密封好，4℃搖晃過液或者室溫搖晃3至四小時，搖晃時能顛倒來回搖動，確保所有beads都能懸在液體中。室溫孵育時間不宜過長，否則會引起非特異性吸附，同時影響抗體質量。

6、非特異性結合的抗體的洗滌 第5步完成后，過柱或者離心去掉血清成份，用PBS洗滌三次。然后再用一個稍稍Harsh一點的體系去洗掉與抗原非特異性結合的蛋白，怎么樣的體系算是比較Harsh呢？ 一種是偏酸或偏堿一點的pH，可以加酸或加堿將PBS或生理鹽水的pH調至偏酸（5.0）或偏堿（8.5）作為洗滌液，用10倍柱體積洗柱一次，也可以直接用150mM Gly，基本不用調pH就是pH=5.0了。另一種體系是高鹽離子濃度，例如可以在PBS里加入NaCl至終濃度為1M，10倍柱體積洗滌一次。兩種體系的本質都是減弱蛋白質分子間的作用力。

7、洗脫 經過第6步的操作后，結合在柱上的抗體就非常純了，同時那些親和力弱的抗體也被洗掉，于是可以開始洗脫了。洗脫方法和上面的洗滌原理基本類似，只是條件更苛刻一點。通常用得比較多的辦法是用pH 2.5左右的HCl（含150mM NaCl）洗脫，也可以采用堿性洗脫液洗脫。洗脫有兩種方式，一種是連續洗脫，另一種是不連續洗脫。前者是連續入加洗脫液，即時監控洗脫情況并隨時決定收集目的抗體組分。不連續洗脫則是分批加入洗脫液，分批收集洗脫流出的成份，zui后再對每一次收集的組分檢測。如果用前一種方法，有一臺紫外監測儀檢測流出組分以便即時監控，后一種方法的檢測則相對比較簡單一些，只要是可以對蛋白質進行定量的方法都可以使用（如Bradford法、Lowery法、BCA法等都可以），總之就是越簡單越好。洗脫過程盡里在低溫完成，洗脫下的組分應該在冰盒上放置，洗脫下來后的成份應該立即調節pH至中性，調節pH應該使用緩沖液，而不應該直接使用強酸或強堿，Na₂HPO₄、Na₂CO₃和Tris等緩沖液是用來作為中和液的不錯選擇。需要指出的是，如果需要將抗體進行偶聯熒光素或者酶的時候，就不能使用Tris作為中和液，否則會影響后面的邊接效率。

8、抗體的保存 抗體純化完后，必須采取合適的保存，否則很容易就失去活性。總的來說有這么幾個方面需要注意：（1）緩沖體系。純化后的抗體必須處于一個相對接近體液的緩沖體系中，一般的PBS體系就足夠了。注意不要引入高濃度的離子，尤其是金屬離子。不要引入干擾抗體實驗的離子或基團。（2）防腐劑。為了防止抗體長菌，必須加入防腐劑，常見的防腐劑有：疊氮鈉、硫柳汞、抗生素（慶大霉素）。疊氮鈉的常用濃度是0.02%，硫柳汞和慶大霉素的常用濃度為0.01%，其中疊氮鈉會抑制HRP酶活性，因此在需要偶聯HRP酶的抗體中不能加這種防腐劑，而且疊氮鈉會影響細胞色素氧化酶活性，會干擾機體的呼吸作用，因此操作時需要注意安全。 硫柳汞對兒童具有潛在毒性，使用時也應注意。（3）穩定劑。向抗體中加入穩定劑可以大其穩定性，常見的穩定劑有多羥基類化合物（二元醇、三元醇等，如濃度為30%-50%的甘油、乙二醇）、二糖類物質（如蔗糖、海藻糖等）、氨基酸、蛋白質（如BSA等），如果抗體需要進行標記，則不可以加入氨基酸、BSA等保護劑。（4）溫度。長期不用時，抗體應該低溫保存，一般采用-20℃保存。短期不用可以放在4℃，但不要超過一周。抗體要避免反復凍融，前面提到的加入甘油等既可以起穩定作用，還可以起防凍的作用。如果有條件，可以把抗體進行冷凍干燥形成凍干粉，放在-80℃。如果抗體尚未純化，直接以血清的方式保存在-20℃以下，也可以很好地保證其活性。（5）濃度。和普通蛋白質一樣，濃度越高就越利于保存。如果抗體濃度太低，可以采用超濾、protein A或Protein G（操作方法參考單抗純化相關介紹）、透析袋等方式濃縮。超濾的方式操作簡單，直接將抗體裝入超濾管再進行離心即可。透析袋濃縮操作也比較簡單，將PEG（分子量大于8000）配成50%左右的溶液，用合適孔徑的透析袋裝好抗體，然后放入PEG溶液中攪拌濃縮即可。關于Protein A或Protein G濃縮的方法將在單抗純化相關頁面講述，需要指出的是這用這兩種親和柱濃縮的損失可能比較大。（6）存儲時間。抗體在-20℃并含有甘油的情況下可以存放數年至十幾年（不要反復拿至溫室）。在4℃存放的時間一般在一個月左右就可以有明顯的效價變化。冷凍干燥的凍干粉低溫可放置幾十年。