雙縮脲法蛋白質含量測定試劑盒說明書

分光光度法 50T/48S

注意：正式測定之前選擇 2-3 個預期差異大的樣本做預測定，確保蛋白濃度在 1～10mg/ml 范圍內。

測定意義：

樣品可溶性蛋白質含量常常用于酶活性計算。此外，可溶性蛋白質含量也用于食品等質量分析。

測定原理：

強堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4 形成紫色絡合物；紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質濃度成正比，而與蛋白質分子量及氨基酸成分無關，故可用來測定蛋白質含量。該方法測定范圍為 1~10mg 蛋白質，適用于蛋白質濃度高的樣品，尤其是動物材料

自備儀器和用品：

可見分光光度計、臺式離心機、可調式移液器、1 ml 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

組成：

標準品：液體 1ml×1 瓶，5 mg/ml，4℃保存。

樣品中可溶性蛋白質提取：

1.        液體樣品：澄清無色液體樣品可以直接測定。

2.        組織樣品：按照組織質量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液（自備，根據需要選用酶提取緩沖液或者蒸餾水或者生理鹽水）冰浴勻漿，8000g，4℃離心 10min，取上清，即待測液。（動物樣品常常需要稀釋）

3.        細菌、真菌：按照細胞數量（104 個）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細胞加入1ml 提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時間 3min）；然后 8000g，4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測。

測定步驟：

1.     分光光度計預熱 30 min，調節波長到 540 nm，蒸餾水調零。

2.     空白管：取 1 mL 玻璃比色皿，加入 200μl 蒸餾水，1000μl 試劑一，混勻后室溫靜置 15 min，于 540nm 比色，記為 A 空白管。

3.     標準管：取 1 mL 玻璃比色皿，加入 200μl 標準液，1000μl 試劑一，混勻后室溫靜置 15 min，于 540 nm 比色，記為 A 標準管。

4.     測定管：取 1 mL 玻璃比色皿，加入 200μl 待測液，1000μl 試劑一，混勻后室溫靜置 15 min，于 540nm 比色，記為 A 測定管。

注意：空白管和標準管只需測定一次。

樣品中蛋白質濃度計算公式

C 待測（mg/mL）= C 標準管×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標準管－A 空白管)

=5×(A 測定管－A 空白管)÷(A 標準管－A 空白管)

注意事項：

1.  樣品蛋白濃度須在 1~10mg/ml 范圍內，低于 1mg/ml 不能用此法，高于 10mg/ml 須做相應稀釋。因此測定前用 1~2 個樣做預實驗，確保蛋白濃度在 1~10mg/ml 范圍內。

2.  待測樣品蛋白提取可用生理鹽水、雙蒸水或不含蛋白的 PBS 提取。該法受硫酸銨、Tris 緩沖液干擾，提取液中應不含這些物質；否則改用BCA 蛋白質含量測定試劑盒。