ELISA實驗是一種利用特定抗體與抗原或半抗原發(fā)生的高選擇性高特異性識別和結(jié)合原理，對待測抗體或者抗原進行分析測定的方法，酶聯(lián)免疫吸附分析（下稱ELISA）是免疫分析的一種，分三個部分組成：免疫識別，信號輸出和數(shù)據(jù)處理。

ELISA實驗中的洗板步驟是確保實驗結(jié)果準確的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，涉及多個關(guān)鍵點：

1. 洗滌參數(shù)：

   - 洗滌量：自動洗板機通常建議使用350µl的洗滌液來確保清洗整個反應(yīng)孔的壁。洗滌量應(yīng)比包被體積稍高，以減少未結(jié)合抗體的背景信號。

   - 均勻性：所有反應(yīng)孔的洗滌量必須一致，確保每次洗滌都達到相同的效果。

2. 洗滌次數(shù)：

   - 一般建議：在每次抗體或抗原孵育后重復(fù)洗滌3次。對于用戶包被的ELISA板，可能需要優(yōu)化洗滌次數(shù)，因為包被平板通常需要的洗滌次數(shù)較少。

   - 平衡背景與信號：過多的洗滌會降低信號強度，而過少則會導(dǎo)致背景值升高。因此，需要找到一個平衡點。

3. 洗板方法：

   - 自動洗板機：使用洗板機可以減少人為因素，提高速度和一致性，但需確保洗板機設(shè)置正確，包括洗滌量和次數(shù)。

   - 手工洗板：手工洗板時，要注意洗液不要溢出孔外，加洗液后靜置1分鐘，然后大力拍干，確保孔內(nèi)無殘留液。

4. 洗液：

   - 配置：使用新鮮的、高質(zhì)量的超純水或雙蒸水配制洗液，避免使用受污染的水。

   - 稀釋倍數(shù)：按照試劑盒說明書稀釋，過高或過低的稀釋倍數(shù)都可能影響洗滌效果。

5. 注意事項：

   - 避免污染：每次加樣和洗滌后，應(yīng)更換封板膜，防止交叉污染。

   - 拍板技巧：手工洗板時，拍板要用力但避免過度，以確保孔內(nèi)無殘留液，同時防止樣本干涸。

   - 重復(fù)性：確保每次操作的加樣量、時間和條件一致，以提高實驗的重復(fù)性。

6. 溫度控制：

   - 溫育：溫育溫度通常為37℃，應(yīng)嚴格控制，避免溫度波動影響反應(yīng)。

   - 避免邊緣效應(yīng)：使用水浴或加熱板使整個板達到均勻溫度，減少邊緣孔與中心孔的溫差。

7. 顯色與終止：

   - 顯色時間：根據(jù)試劑盒說明控制顯色時間，避免過長導(dǎo)致背景增高或過短導(dǎo)致結(jié)果偏低。

   - 終止液：加入終止液時要確保無氣泡，終止反應(yīng)后立即讀數(shù)。

8. 問題排查：

   - 背景高：可能是洗滌不徹di或洗滌次數(shù)不足。

   - 白板：可能是忘記加酶或顯色液，或試劑污染。

   - 重復(fù)性差：檢查加樣量、操作時間和條件是否一致，以及樣本和試劑的穩(wěn)定性。

遵循這些關(guān)鍵點和注意事項，可以有效提高ELISA實驗的準確性和重復(fù)性，確保實驗結(jié)果的可靠性。