一、背景

MN9D小鼠中腦多巴胺能神經元細胞來源于一位72歲的男性結直腸癌患者的肺部轉移灶；皮下接種至BALB/c裸鼠并連續傳代23次后建立該細胞系。在裸鼠身上傳代的過程中，該腫瘤仍保持原始的結直腸癌的組織學特性。該細胞有多種肽類激素和神經遞質的受體，維持電解質的定向運輸。

二、細胞培養步驟

復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補加4-6mL培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養瓶中培養過夜（或將細胞懸液加入6cm皿中），培養過夜。第二天換液并檢查細胞密度。

細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。

對于貼壁細胞，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養瓶中，置于37℃培養箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加5ml以上含10%血清的培養基終止消化。

3.輕輕吹打細胞，脫落后吸出，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養液后吹勻。

4.按5-6ml/瓶補加培養液，將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培養液的新皿中或者瓶中。

三、應用

用于mTOR信號通路在雷帕霉素調控錳誘導MN9D細胞凋亡中的作用研究：

以小鼠中腦多巴胺能神經元細胞（MN9D）為模型,探討雷帕霉素在調控錳誘導MN9D細胞凋亡中的作用及可能機制,探討mTOR信號通路在雷帕霉素調控錳誘導MN9D細胞凋亡中作用及其可能機制,為防治職業人群錳中毒提供研究基礎。

方法：

1、MN9D細胞在雷帕霉素（0.1μg/ml）預處理1h后分別暴露1.2和2.4m M錳24h。然后,觀察細胞形態、臺盼藍染色計數活細胞數量、Annexin V/PI雙染色后用流式細胞儀檢測細胞凋亡率、Western blot分析MN9D細胞caspase-3激活程度。

2、MN9D細胞在雷帕霉素RAP（0.1μg/ml）/mTOR激動劑MHY（1μM）預處理1h后暴露1.2 m M錳24h。然后,觀察細胞形態、臺盼藍染色計數活細胞數量、Annexin V/PI雙染色后用流式細胞儀檢測細胞凋亡率、western blot分析MN9D細胞caspase-3激活和mTOR相關蛋白變化。

結果：

1、與對照組相比,錳以濃度依賴的方式誘導MN9D細胞活性下降和形態改變,凋亡率逐漸升高,cleaved-caspase-3蛋白表達量也逐漸升高,差異有統計學意義（P<0.05）。而與染錳組相比,雷帕霉素預處理能夠明顯削弱錳誘導的MN9D細胞活性下降和調亡表現,阻滯錳誘導caspase-3激活,差異有統計學意義（P<0.05）。

2、與對照組相比,單獨染錳組MN9D細胞活性下降和形態改變,凋亡率增加,差異有統計學意義（P<0.05）;cleaved-caspase-3蛋白表達量增加,差異有統計學意義（P<0.05）;AKT和和S6K1、4E-BP1蛋白磷酸化表達量增加,差異有統計學意義（P<0.05）。

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