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內質網染色試劑盒的使用細節需根據具體試劑類型和實驗需求進行調整，以下結合不同試劑盒的特點及操作要點進行詳細說明：
一、試劑準備與工作液配制
1. 染料特性與分裝：
- 常用探針如E01(藍色熒光，Ex/Em=373/430nm)、ER Green(綠色熒光，Ex/Em=490/520nm)或ER示蹤劑&8482;紅(紅色熒光，Ex/Em=589/620nm)，需根據實驗需求選擇。
- 染料母液通常為DMSO溶液，需避免反復凍融。建議使用時分裝為小管，每管一次性使用，長期保存需-20℃避光。
2. 工作液稀釋：
- 初始稀釋：用染料稀釋液將母液稀釋10倍，再用HBSS緩沖液或培養基進一步稀釋50-500倍(貼壁細胞)或20-100倍(需固定/透化的樣本)。
- 濃度優化：最終工作濃度需根據細胞類型預實驗確定，原則是“至低有效濃度”，避免背景干擾和細胞毒性。
二、細胞染色流程
1. 貼壁細胞染色：
- 預處理：棄去培養基，用HBSS緩沖液輕洗細胞1次，移除殘留血清或酚紅(可能干擾熒光)。
- 孵育：加入預熱的染色工作液(37℃)，覆蓋細胞即可。孵育時間15-40分鐘，需避光操作。
- 清洗：吸除染液，用新鮮培養基或HBSS洗滌3次，去除游離探針。
2. 懸浮細胞染色：
- 重懸染色：離心棄上清，用預熱的染色工作液重懸細胞，37℃孵育15-40分鐘[。
- 貼壁輔助：可選多聚賴氨酸處理蓋玻片，使細胞貼附后染色，后續操作同貼壁細胞。
三、固定與透化(可選)
1. 固定：
- 用含2-4%甲醛的HBSS或培養基固定細胞10分鐘，室溫或37℃均可。固定后熒光信號可能部分衰減，需優化固定條件。
2. 透化：
- 去污劑法：0.2% Triton X-100的PBS孵育10分鐘，適用于免疫染色(ICC)前處理。
- 丙酮法：預冷丙酮透化5分鐘，可降低背景信號，但可能破壞部分膜結構。
四、觀察與數據采集
1. 濾光片選擇：
- 根據探針調整顯微鏡濾光片，如FITC通道(綠色)、德州紅通道(紅色)或自定義波段。
2. 活細胞與固定細胞差異：
- 活細胞染色需快速操作，避免長時間暴露導致探針泄漏；固定細胞可延長觀察時間，但需平衡固定造成的信號損失。
五、關鍵注意事項
1. 操作細節：
- DMSO母液冬季易凝固，需預熱至室溫并離心回收液體，吸頭需預熱防止染料吸附。
- 避光操作：探針對光敏感，染色及洗滌過程需盡量減少光照。
2. 兼容性與污染控制：
- 避免與其他品牌試劑混用，防止交叉污染。
- 使用一次性耗材，玻璃器皿需清洗并去除殘留清潔劑。
3. 實驗優化：
- 濃度與時間：不同細胞膜通透性差異大(如腫瘤細胞vs原代細胞)，需預實驗調整染色條件。
- 多色染色：可搭配其他熒光標記(如F-actin綠色、細胞核藍色)，但需驗證探針光譜重疊性。
六、常見問題與解決方案
1. 背景過高：
- 降低探針濃度或縮短孵育時間。
- 增加洗滌次數或改用低吸附耗材。
2. 染色不均：
- 確保工作液覆蓋均勻，懸浮細胞需輕柔混勻。
- 貼壁細胞可延長孵育時間至30分鐘。
3. 熒光衰減：
- 固定后信號減弱屬正常現象，可通過延長成像時間或提高激發強度補償。
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