一、背景

人骨髓間充質干細胞分離液用于人骨髓間充質干細胞的分離，主要用于人骨髓間充質干細胞的原代培養等研究。目前常用的分離hMSCs的方法主要有全骨髓法和密度梯度離心法，全骨髓法即根據干細胞在低血清培養基中有貼壁優勢特性，定期換液除去不貼壁細胞，從而達到純化及擴增MSC的目的。密度梯度離心法即根據骨髓中各細胞成分比重的不同，分離單核細胞進行貼壁培養。二者本質上無多大區別。隨著對MSC表面抗原認識的深入，又有人利用免疫方法如流式細胞儀法、免疫磁珠法等對其進行分離純化。但經過流式或磁珠分選后的細胞出現了增殖緩慢等一些問題，加之成本較高和技術的難度，在某種程度上限制了這些方法的廣泛應用。

人骨髓間充質干細胞分離培養方法：

(1)無菌條件下抽取骨髓液5mL，用等體積PBS稀釋混勻，室溫下1500rpm離心10分鐘；

(2)棄去脂肪層，將稀釋骨髓液沿離心管壁緩慢加到等體積Ficoll分離液（1.077g/mL）上面，室溫2500rpm離心30分鐘；

(3)吸取界面白膜狀層的單個核細胞，用PBS混懸后，室溫1500rpm離心10分鐘；

(4)棄上清并重復洗滌2次。

(5)用含10%FBS的LG—DMEM培養液（或骨髓間充質干細胞專用培養基）重懸細胞，調整細胞密度為2x105/mL，接種于底面積為25cm2培養瓶中置于37℃、5%CO2培養箱中進行培養；

(6)于3天后換液，棄去懸浮細胞后，每2-3天換液一次；

(7)每日鏡下觀察細胞形態及生長變化，待細胞生長達80%-90%融合時，用胰蛋白酶-EDTA溶液（0.25%:0.02%）進行消化，按1：2比例進行傳代培養。

二、應用

用于人骨髓間充質干細胞的分離、培養及鑒定研究：

建立人骨髓間充質干細胞（mesenchymal stem cells,MSCs）體外分離、培養及擴增的方法,觀察MSCs體外培養增殖的生物學特性,并應用流式細胞術,檢測細胞表型,分析鑒定MSCs的純度。

方法：

（1）無菌條件下抽取骨髓液5mL,用等體積PBS稀釋混勻,室溫下1500rpm離心10分鐘,棄去脂肪層,將稀釋骨髓液沿離心管壁緩慢加到等體積Ficoll分離液（1.077g/mL）上面,室溫2500rpm離心30分鐘,吸取界面白膜狀層的單個核細胞。用PBS混懸后,室溫1500rpm離心10分鐘,棄上清并重復洗滌2次。用含10%FBS的LG—DMEM培養液重懸細胞,調整細胞密度為2x105/mL,接種于底面積為25cm2培養瓶中置于37℃、5%CO2培養箱中進行培養。3天后換液,棄去懸浮細胞后,每2-3天換液一次。每日鏡下觀察細胞形態及生長變化,待細胞生長達80%-90%融合時,用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA（1:1,V/V）進行消化,再按1：2比例進行傳代培養,共傳代三次。

（2）MSCs的生長曲線測定：取P3細胞,按5×104/mL濃度接種于24孔培養板培養,每天取3孔,計算平均值,連續培養8天,采用血球計數板計數法,繪制生長曲線。

（3）貼壁率測定：取P3細胞,按5×104/mL濃度接種于25cm2培養瓶內培養,每2小時取2瓶,消化計數,計算貼壁率,繪制貼壁率曲線。

（4）MSCs的表型鑒定：取P3細胞,將細胞消化吹打制成單細胞懸液,1500rpm離心5分鐘,棄去上清液,用PBS重復洗滌后,調整細胞濃度為5×106/mL,各取細胞懸液100μL,分別滴加熒光標記抗人CD34-PE、CD44-FITC、CD29-PEcy5.5、CD105-FITC、HLA-DR-PE抗體10μL,4℃避光孵育30分鐘,PBS洗滌后應用流式細胞儀進行檢測,確定MSCs的表面標志物的表達情況。

結果：MSCs屬于骨髓中的單個核細胞,采用密度梯度離心法與貼壁篩選法相結合可以有效分離、純化人骨髓MSCs。細胞形態觀察：細胞初接種入培養瓶時為圓形的單個核細胞,大小不一,與周圍的血細胞相互混雜。

培養24小時后,細胞開始出現貼壁,48-72小時細胞貼壁逐漸增多,72小時換液后,可見少量分散的短梭形及不規則多角形的初始貼壁細胞。第4-8天細胞生長快,呈集落樣生長,可見有粗大的突起伸出,細胞形態呈梭形。第10-12天后細胞克隆進一步擴大,呈大的長梭形,培養至第14-16天時貼壁細胞可達80%～90%融合,大量貼壁細胞呈長梭狀成纖維細胞樣形態并列或呈漩渦狀排列。

傳代細胞剛接種時為圓形,較大,24小時內能貼壁,伸展呈梭形,增殖迅速,5-7天細胞融合可達90%。細胞形態均勻,與成纖維細胞形態相似,大部分呈長梭狀,排列規則。

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