在細(xì)胞生物學(xué)研究領(lǐng)域，永生化人軟骨細(xì)胞 - hTERT 是一種具科研價值的細(xì)胞模型。這種細(xì)胞通過引入人體端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）基因，使原本具有有限分裂次數(shù)的正常軟骨細(xì)胞突破 Hayflick 極限，實現(xiàn)無限增殖，同時很大程度上保留了軟骨細(xì)胞的正常表型和功能特性，為軟骨發(fā)育、疾病機(jī)制、藥物篩選以及組織工程等研究方向提供了穩(wěn)定且可持續(xù)的實驗材料。

一、hTERT 在細(xì)胞永生化中的關(guān)鍵作用

（一）端粒與細(xì)胞衰老的關(guān)系

端粒是染色體末端的特殊結(jié)構(gòu)，由 tandem repeats of TTAGGG 序列及其結(jié)合蛋白組成。每次細(xì)胞分裂時，由于 DNA 聚合酶無法復(fù)制線性 DNA 末端，端粒會逐漸縮短。當(dāng)端粒長度縮短至臨界值時，細(xì)胞就會啟動衰老程序，停止分裂。正常的體細(xì)胞端粒長度有限，分裂次數(shù)也受到嚴(yán)格限制，這便是 Hayflick 現(xiàn)象。

（二）hTERT 對端粒長度的維持機(jī)制

hTERT 是端粒酶的重要組成部分，端粒酶是一種能以自身 RNA 為模板，向染色體末端添加 TTAGGG 重復(fù)序列的逆轉(zhuǎn)錄酶。在正常體細(xì)胞中，端粒酶活性極低甚至缺失，而通過外源性導(dǎo)入 hTERT 基因，可重新激活端粒酶活性。激活后的端粒酶能夠不斷修復(fù)端粒在細(xì)胞分裂過程中的縮短部分，使得軟骨細(xì)胞具備了持續(xù)分裂的能力，從而實現(xiàn)永生化轉(zhuǎn)變。

（三）hTERT 轉(zhuǎn)染方法與效率優(yōu)化

1. 病毒載體轉(zhuǎn)染

• 常用的病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和慢病毒載體。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體整合效率較高，可在軟骨細(xì)胞基因組中穩(wěn)定整合 hTERT 基因，但其裝載容量有限，對基因片段大小有一定要求。例如，早期一些研究利用 Moloney 肌肉瘤病毒衍生的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，將 hTERT 基因?qū)胲浌羌?xì)胞，實現(xiàn)了細(xì)胞永生化，但該載體可能引起細(xì)胞基因組不穩(wěn)定等潛在風(fēng)險。

• 慢病毒載體具有更高的基因轉(zhuǎn)染效率和更廣泛的宿主范圍，能夠高效感染不分裂或緩慢分裂的軟骨細(xì)胞。其優(yōu)勢在于可以同時攜帶多個基因片段，除了 hTERT 基因外，還可以共轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白（GFP）等報告基因，便于對轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行動態(tài)追蹤和篩選。然而，慢病毒載體的制備相對復(fù)雜，且存在一定的生物安全性問題，需在嚴(yán)格的安全防護(hù)條件下操作。

2. 非病毒載體轉(zhuǎn)染

• 包括脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和電穿孔轉(zhuǎn)染。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法利用脂質(zhì)分子與 DNA 形成的復(fù)合物，通過與細(xì)胞膜的融合將 hTERT 基因?qū)爰?xì)胞。這種方法操作相對簡便，對細(xì)胞的損傷較小，但轉(zhuǎn)染效率相對較低，且導(dǎo)入的基因在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定表達(dá)時間有限。例如，在一些初步的軟骨細(xì)胞永生化實驗中，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 hTERT 基因，發(fā)現(xiàn)部分細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后短期內(nèi)表達(dá) hTERT，但隨著時間推移，基因表達(dá)逐漸減弱。

• 電穿孔轉(zhuǎn)染法則通過短暫的電脈沖使細(xì)胞膜產(chǎn)生可逆性孔洞，促進(jìn) DNA 進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。其轉(zhuǎn)染效率較高，尤其適用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型，如軟骨細(xì)胞。但電穿孔條件（如電壓、脈沖時間等）需要精確優(yōu)化，否則可能導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡。研究發(fā)現(xiàn)，通過調(diào)整電穿孔參數(shù)，可使軟骨細(xì)胞 hTERT 基因轉(zhuǎn)染效率達(dá)到 60% - 80%，同時保持較高的細(xì)胞存活率（70% - 85%）。

二、永生化人軟骨細(xì)胞 - hTERT 的科研應(yīng)用優(yōu)勢

（一）穩(wěn)定實驗?zāi)Ｐ偷臉?gòu)建

在軟骨發(fā)育研究中，利用永生化人軟骨細(xì)胞 - hTERT 可長期、穩(wěn)定地進(jìn)行細(xì)胞增殖、分化相關(guān)實驗。與原代軟骨細(xì)胞相比，這些細(xì)胞擺脫了頻繁獲取新鮮組織樣本的限制，解決了原代細(xì)胞批次間差異大、培養(yǎng)周期短等問題。例如，在研究軟骨細(xì)胞分化過程中的關(guān)鍵信號通路（如 BMP、Wnt/β - catenin 通路）時，可反復(fù)傳代培養(yǎng)永生化細(xì)胞，進(jìn)行長時間的信號通路激活與抑制實驗，深入探究其對軟骨細(xì)胞分化各個階段的影響。

（二）疾病機(jī)制研究中的精準(zhǔn)模擬

對于軟骨退行性疾病（如骨關(guān)節(jié)炎）的研究，永生化人軟骨細(xì)胞 - hTERT 能夠模擬疾病發(fā)生過程中的細(xì)胞病理生理變化。通過在細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中添加炎癥因子（如白細(xì)胞介素 - 1β、腫瘤壞死因子 - α）或機(jī)械應(yīng)力刺激，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的分子和細(xì)胞學(xué)改變，如細(xì)胞外基質(zhì)降解、炎性介質(zhì)分泌增加等。由于細(xì)胞具備永生化特性，研究人員可以持續(xù)觀察疾病發(fā)生發(fā)展的動態(tài)過程，深入分析細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常、基因表達(dá)調(diào)控紊亂等機(jī)制，為尋找疾病治療靶點提供可靠依據(jù)。

（三）藥物篩選與毒性評估的高效平臺

在藥物研發(fā)領(lǐng)域，永生化人軟骨細(xì)胞 - hTERT 為軟骨保護(hù)藥物和骨關(guān)節(jié)炎治療藥物的篩選提供了高效、穩(wěn)定的體外模型。可以建立高通量篩選系統(tǒng)，將大量候選藥物與細(xì)胞共孵育，通過檢測細(xì)胞活性、細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解指標(biāo)、炎性反應(yīng)水平等，快速評估藥物對軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用或潛在毒性。例如，在篩選針對軟骨細(xì)胞凋亡的抑制劑時，利用永生化細(xì)胞進(jìn)行大規(guī)模藥物篩選，可在短時間內(nèi)獲得大量實驗數(shù)據(jù)，加速藥物研發(fā)進(jìn)程，提高研發(fā)效率。