在細(xì)胞研究領(lǐng)域，永生化人牙齦成纖維細(xì)胞 - hTERT 是一種具有價值的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。通過引入 hTERT 基因，這些細(xì)胞能夠突破細(xì)胞衰老的限制，實(shí)現(xiàn)無限增殖，同時保留了牙齦成纖維細(xì)胞的正常表型和功能。這使得它們在細(xì)胞生物學(xué)、組織工程、藥物篩選等多個研究方向上有著廣泛的應(yīng)用。接下來，將從技術(shù)參數(shù)的角度深入解析這一細(xì)胞系的特點(diǎn)與應(yīng)用。

一、細(xì)胞增殖活性檢測

（一）MTT 法原理與優(yōu)化

MTT 法是一種常用的細(xì)胞增殖活性檢測方法。其原理是活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶可將 MTT 還原為不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶 formazan，而死細(xì)胞因缺乏這種酶活性無法進(jìn)行還原反應(yīng)。通過測定 formazan 在特定波長（570nm）的吸光度值，可間接反映細(xì)胞增殖情況。在研究永生化人牙齦成纖維細(xì)胞 - hTERT 時，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件至關(guān)重要。例如，細(xì)胞接種密度應(yīng)控制在 5×103 - 1×10? cells/well，以確保細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)期間處于對數(shù)生長期。同時，MTT 試劑的濃度和孵育時間也需優(yōu)化，一般 MTT 試劑濃度為 0.5mg/mL，孵育時間為 4 - 6 小時。

（二）CCK - 8 法的優(yōu)勢與應(yīng)用

CCK - 8 法與 MTT 法類似，但其底物 WST - 8 在活細(xì)胞線粒體中被還原為水溶性的 formazan 染料，無需進(jìn)行細(xì)胞溶解步驟，操作更為簡便。其優(yōu)勢在于靈敏度高，尤其適用于低濃度細(xì)胞增殖檢測。在研究細(xì)胞對不同藥物的響應(yīng)時，CCK - 8 法可快速、準(zhǔn)確地評估細(xì)胞增殖活性變化。例如，在篩選促進(jìn)牙齦組織修復(fù)的藥物時，通過 CCK - 8 法檢測細(xì)胞增殖情況，可快速篩選出潛在的有效藥物。

二、細(xì)胞周期分析

（一）流式細(xì)胞術(shù)原理與操作

流式細(xì)胞術(shù)是一種基于細(xì)胞 DNA 含量變化來分析細(xì)胞周期分布的技術(shù)。通過將細(xì)胞固定、滲透處理后，加入 DNA 染料（如 PI 或 7 - ADD），染料可嵌入 DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)中，其熒光強(qiáng)度與 DNA 含量成正比。利用流式細(xì)胞儀檢測每個細(xì)胞的熒光信號，經(jīng)軟件分析可得到細(xì)胞在 G0/G1、S、G2/M 期的比例分布。在操作過程中，細(xì)胞固定是關(guān)鍵步驟之一。常用 70% 乙醇在 - 20℃下固定細(xì)胞，固定時間不少于 4 小時，但不宜超過 7 天，以免 DNA 降解影響檢測結(jié)果。

（二）細(xì)胞周期檢測的應(yīng)用場景

在研究細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制時，細(xì)胞周期分析是很需要的工具。例如，在探討不同生長因子對永生化人牙齦成纖維細(xì)胞 - hTERT 增殖的影響時，通過流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布，可了解生長因子如何影響細(xì)胞周期進(jìn)程。若某一生長因子使細(xì)胞在 S 期的比例顯著增加，表明該因子可能促進(jìn)了細(xì)胞 DNA 合成，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖。

三、細(xì)胞凋亡檢測

（一）Annexin V - FITC/PI 雙染法原理

Annexin V - FITC/PI 雙染法是檢測早期凋亡細(xì)胞的常用方法。Annexin V 可特異性結(jié)合細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸（PS），而 PS 在正常細(xì)胞中位于膜內(nèi)側(cè)，細(xì)胞凋亡早期會外翻至膜外側(cè)。FITC（異硫氰酸熒光素）標(biāo)記的 Annexin V 可標(biāo)記早期凋亡細(xì)胞；PI（碘化丙啶）則無法穿透完整細(xì)胞膜，僅對晚期凋亡或壞死細(xì)胞的核進(jìn)行染色。通過流式細(xì)胞儀檢測，可區(qū)分活細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。在實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞染色后應(yīng)盡快上機(jī)檢測，一般在 1 小時內(nèi)完成檢測，以避免細(xì)胞凋亡進(jìn)程的進(jìn)一步發(fā)展影響檢測結(jié)果。

（二）TUNEL 法的應(yīng)用場景

TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase - mediated dUTP nick end labeling）法是一種檢測 DNA 斷裂的細(xì)胞凋亡原位檢測方法。其原理是細(xì)胞凋亡時，DNA 雙鏈斷裂產(chǎn)生 3' - OH 末端，TUNEL 反應(yīng)體系中的末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）可將生物素或熒光素標(biāo)記的 dUTP 連接到這些末端，經(jīng)熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測可定位凋亡細(xì)胞。TUNEL 法適用于研究細(xì)胞在受到物理、化學(xué)損傷后的凋亡情況，尤其在細(xì)胞貼壁培養(yǎng)狀態(tài)下，可直觀觀察細(xì)胞形態(tài)與凋亡信號的關(guān)系。例如，在研究藥物對細(xì)胞的毒性作用時，TUNEL 法可直觀顯示細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化。

四、細(xì)胞表型與功能分析

（一）細(xì)胞表型標(biāo)志物檢測

免疫熒光染色法

免疫熒光染色法利用熒光標(biāo)記的抗體特異性識別細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)抗原，通過熒光顯微鏡觀察其表達(dá)和定位。對于永生化人牙齦成纖維細(xì)胞 - hTERT，常用標(biāo)志物包括波形蛋白（Vimentin）、纖維連接蛋白（Fibronectin）等。例如，波形蛋白是中間絲蛋白，在成纖維細(xì)胞中高度表達(dá)。通過免疫熒光染色可直觀觀察其在細(xì)胞內(nèi)的分布情況，評估細(xì)胞的成纖維細(xì)胞表型維持程度。在實(shí)驗(yàn)操作中，需注意抗體的選擇與驗(yàn)證，確保其特異性和靈敏度符合要求。

Western blot 分析

Western blot 是一種用于檢測蛋白質(zhì)表達(dá)水平的經(jīng)典方法。通過 SDS - PAGE 電泳分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜后用特異性抗體進(jìn)行雜交，顯色后可通過凝膠成像系統(tǒng)定量分析目標(biāo)蛋白的表達(dá)量。對于永生化人牙齦成纖維細(xì)胞 - hTERT，Western blot 可精確檢測表型相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。例如，在研究細(xì)胞在不同培養(yǎng)條件下的表型穩(wěn)定性時，通過 Western blot 檢測波形蛋白、纖維連接蛋白的表達(dá)量，可深入探究培養(yǎng)條件對細(xì)胞表型的影響。

（二）細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解分析

糖胺聚糖（GAG）含量測定

糖胺聚糖是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分，其含量可反映細(xì)胞的合成代謝活性。常用的方法是 Blyscan 硫酸糖胺聚糖比色測定試劑盒，其原理是利用 1,9 - 二甲基亞甲基藍(lán)與硫酸糖胺聚糖特異性結(jié)合，產(chǎn)生藍(lán)色復(fù)合物，在 656nm 波長處有特征吸收峰。通過測定吸光度值并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，可定量分析細(xì)胞培養(yǎng)上清或組織勻漿中 GAG 含量。在研究細(xì)胞對不同刺激的響應(yīng)時，GAG 含量測定可評估細(xì)胞的基質(zhì)合成能力。例如，在研究生長因子對細(xì)胞外基質(zhì)合成的促進(jìn)作用時，通過 GAG 含量測定可量化評估其效果。

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）活性檢測

基質(zhì)金屬蛋白酶是一類能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)的酶，在組織重塑和疾病過程中發(fā)揮重要作用。采用明膠酶譜法（Zymography）可檢測 MMPs 活性。將細(xì)胞培養(yǎng)上清與含有明膠的 SDS - PAGE 凝膠進(jìn)行電泳，MMPs 在凝膠中水解明膠形成透明帶，通過凝膠成像系統(tǒng)分析透明帶位置和大小，可初步判斷 MMPs 的類型和活性。若需精確測定 MMPs 活性，可使用熒光標(biāo)記的底物法，根據(jù)熒光強(qiáng)度變化計算酶活性單位。在研究細(xì)胞在炎癥環(huán)境下的基質(zhì)降解情況時，MMPs 活性檢測可揭示細(xì)胞外基質(zhì)降解機(jī)制。

五、細(xì)胞信號通路分析

（一）hTERT 信號通路關(guān)鍵蛋白檢測

免疫共沉淀技術(shù)

免疫共沉淀技術(shù)可用于檢測 hTERT 信號通路中蛋白質(zhì)之間的相互作用。例如，研究 hTERT 與細(xì)胞周期相關(guān)蛋白（如 p16、p53）的結(jié)合情況時，先用抗 p53 抗體孵育細(xì)胞裂解液，使 p53 蛋白與抗體結(jié)合形成免疫復(fù)合物，通過蛋白 A/G 瓊脂糖凝膠捕獲復(fù)合物，經(jīng)洗滌后用抗 hTERT 抗體進(jìn)行 Western blot 檢測，驗(yàn)證兩者相互作用。在實(shí)驗(yàn)過程中，需優(yōu)化抗體濃度、孵育時間和洗滌條件，以提高免疫共沉淀的特異性和效率。

酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）

Ras 活性檢測 ELISA 試劑盒是一種快速、簡便的檢測方法。其原理是利用 hTERT 蛋白與下游效應(yīng)分子的特異性結(jié)合，將生物素標(biāo)記的效應(yīng)分子固定在微孔板上，加入細(xì)胞裂解液后，活化的 hTERT 蛋白與之結(jié)合，再通過抗 hTERT 抗體和酶標(biāo)記二抗進(jìn)行顯色反應(yīng)，吸光度值與活化 hTERT 蛋白量成正比。該方法適用于高通量篩選實(shí)驗(yàn)，可快速評估不同處理?xiàng)l件下 hTERT 信號通路的激活狀態(tài)。

（二）下游信號通路磷酸化水平分析

Western blot 檢測磷酸化蛋白

Western blot 是分析信號通路磷酸化水平的常用方法。以 MAPK 信號通路為例，使用特異性抗磷酸化 ERK1/2 抗體，可檢測 ERK1/2 蛋白的磷酸化水平，反映信號通路的激活程度。在實(shí)驗(yàn)中，需使用磷酸酶抑制劑處理細(xì)胞裂解液，防止磷酸化蛋白在提取過程中去磷酸化。同時，應(yīng)設(shè)置總蛋白抗體作為內(nèi)參，校正蛋白加載量差異，確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)磷酸化蛋白

流式細(xì)胞術(shù)也可用于檢測細(xì)胞內(nèi)磷酸化蛋白水平。通過固定、透化細(xì)胞后，用熒光標(biāo)記的抗磷酸化蛋白抗體進(jìn)行染色，利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)熒光信號強(qiáng)度。該方法的優(yōu)勢在于可同時檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物和內(nèi)源性磷酸化蛋白，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分群和信號通路分析的結(jié)合。例如，在研究不同細(xì)胞亞群對藥物刺激的響應(yīng)時，流式細(xì)胞術(shù)可提供細(xì)胞群體水平的信號通路激活信息。