一、細胞概述

永生化小鼠 Floxed Fam20c 牙乳頭間充質細胞是一種經過特殊處理的細胞系，其來源于小鼠牙乳頭組織。在正常生理狀態下，牙乳頭間充質細胞對于牙齒的發育和形成起著關鍵作用，它們能夠分化為成牙本質細胞等，參與牙本質的合成與礦化。而該細胞系通過特定的基因操作，實現了在體外條件下的永生化培養，這為長期穩定的細胞實驗研究提供了基礎。

Floxed Fam20c 指的是在 Fam20c 基因周圍引入了 Flox 序列，這一設計使得在特定的 Cre 酶作用下，可以實現對該基因的特異性敲除，從而方便研究 Fam20c 基因在細胞功能及相關生物學過程中的作用機制。

二、細胞培養前準備

（一）培養皿與培養基

在開始細胞培養前，需選擇合適的培養皿。一般推薦使用經過認證的細胞培養專用皿，這些培養皿表面經過特殊處理，有利于細胞的貼壁和生長。對于永生化小鼠 Floxed Fam20c 牙乳頭間充質細胞，常用的培養基成分為基礎培養基（如 Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM）添加適量的胎牛血清（通常為 10% - 15%）、青霉素 - 鏈霉素溶液（以防止細菌和真菌污染，濃度一般為 100 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 鏈霉素）以及一些必要的生長因子和營養添加劑，如 insulin-transferrin-selenium（ITS）等。不同實驗室根據具體實驗需求可能會對培養基成分進行微調，但上述基礎成分是較為通用的組合。

（二）細胞復蘇

從凍存狀態復蘇細胞是細胞培養的起始步驟。正確的復蘇操作可以確保細胞的活性和正常生長。首先，準備好 37℃左右的水浴鍋，將含有凍存細胞的凍存管從液氮罐中迅速取出，立即放入水浴鍋中快速搖動，使細胞在短時間內（一般 1 - 2 分鐘）融化。然后，用 75% 的酒精對凍存管外部進行消毒，避免外界細菌、真菌等污染細胞。在無菌操作臺內，將凍存管內的細胞懸液快速加入到含有適量培養基的離心管中，輕輕吹打混勻，使細胞分散均勻。接著進行離心（一般為 1000 - 1200rpm，5 分鐘左右），棄去上清液，加入新鮮培養基重懸細胞，將細胞懸液轉移至培養皿中，輕輕晃動培養皿使細胞均勻分布，放入 37℃、5% CO?的細胞培養箱中靜置培養，讓細胞逐漸恢復活性并開始貼壁生長。

三、細胞培養過程操作

（一）細胞觀察與記錄

定期觀察細胞的生長狀態是細胞培養過程中的重要環節。一般每天至少觀察一次細胞，觀察內容包括細胞的形態、顏色、是否有沉淀物或漂浮物等。正常生長的永生化小鼠 Floxed Fam20c 牙乳頭間充質細胞通常呈多邊形或紡錘形，細胞邊緣清晰，胞質均勻，顏色為淡黃色或透明。若細胞出現顏色變深、渾濁或有大量漂浮物，則可能提示細胞受到污染或生長狀態不佳。同時，要記錄細胞的生長情況，如細胞的密度變化、培養基的更換時間等，以便對細胞生長規律有清晰的了解，為后續實驗安排提供依據。

（二）細胞傳代

當細胞生長到一定密度（一般達到培養皿面積的 80% - 90% 左右）時，就需要進行傳代操作，以防止細胞因密度過高而出現接觸抑制，影響細胞的正常生長和功能。傳代前，先用 PBS（磷酸鹽緩沖液）輕輕沖洗培養皿，去除細胞表面的培養基和雜質。然后加入適量的胰蛋白酶 - EDTA 溶液（常用濃度為 0.25% 胰蛋白酶和 0.02% EDTA），在 37℃、5% CO?的培養箱中孵育 1 - 2 分鐘，觀察細胞是否開始脫落。若細胞未全脫落，可輕輕敲擊培養皿側壁，促使細胞脫離培養皿表面。待細胞大部分脫落形成細胞懸液后，加入適量的含血清培養基終止胰蛋白酶的作用，將細胞懸液轉移至離心管中，進行離心（條件同前），棄去上清液，加入新鮮培養基重懸細胞，按照適當的比例（如 1:2 或 1:3）將細胞分配到新的培養皿中，繼續放入培養箱培養。

（三）細胞凍存

對于多余的細胞或需要長期保存的細胞系，凍存是常用的保存方法。凍存前，用胰蛋白酶消化細胞并收集細胞懸液，離心后棄去上清液。加入適量的凍存液（一般凍存液的成分為 90% 胎牛血清和 10% 二甲基亞砜（DMSO）），輕輕吹打使細胞均勻分散在凍存液中。將細胞懸液分裝至凍存管中，每管一般裝 1 - 1.5ml。然后將凍存管放入程序降溫盒中（如果沒有程序降溫盒，也可以采用緩慢手動降溫的方法，如先在 4℃放置 30 分鐘，再在 - 20℃放置 1 - 2 小時，最后轉移到 - 80℃冰箱中），使細胞緩慢降溫，最后將凍存管轉移至液氮罐中長期保存。

四、細胞實驗應用操作

（一）基因轉染實驗

該細胞系常用于基因轉染實驗，以研究特定基因在細胞中的功能。在進行基因轉染前，需確保細胞處于良好的生長狀態，細胞密度一般在 70% - 80% 左右較為合適。對于質粒轉染，常用脂質體介導的轉染方法。首先，將質粒 DNA 與脂質體轉染試劑按照一定比例（如 1:2 或 1:3）在無血清培養基中混合，室溫孵育 15 - 30 分鐘，使脂質體與質粒形成轉染復合物。然后將轉染復合物加入到細胞培養皿中，輕輕晃動培養皿使復合物均勻分布。轉染后 6 - 8 小時，可更換為含有血清的培養基，以維持細胞的正常生長。一般在轉染后 24 - 72 小時，根據所轉染基因的特點和實驗需求，通過熒光顯微鏡觀察轉染效率（如果質粒攜帶熒光報告基因）或進行相關基因功能檢測實驗，如檢測基因表達水平（采用實時熒光定量 PCR 或 Western blot 等方法）或細胞生物學功能變化（如細胞增殖、遷移、分化等實驗）。

（二）細胞分化誘導實驗

永生化小鼠 Floxed Fam20c 牙乳頭間充質細胞具有一定的分化潛能，可以用于細胞分化誘導實驗研究。在誘導分化前，同樣要保證細胞生長狀態良好。將細胞以適當密度接種到培養皿中，待細胞貼壁后，更換為分化誘導培養基。分化誘導培養基的成分根據所期望的分化方向而有所不同，例如，若要誘導其向成牙本質細胞分化，通常需要在基礎培養基中添加 β - 甘油磷酸鈉、抗壞血酸等誘導因子。在誘導分化過程中，定期更換誘導培養基（一般每 2 - 3 天更換一次），同時觀察細胞形態的變化以及檢測分化相關標志物的表達情況。可以通過免疫熒光染色檢測特定分化細胞的標志性蛋白表達，如檢測成牙本質細胞分化的標志性蛋白 dentin sialophosphoprotein（DSPP）的表達情況，從而判斷細胞分化的程度和效果。