一、細胞特性與應用價值

永生化人牙周膜成纖維細胞 - SV40 是一種經過特殊處理的細胞系，其通過將 SV40 大 T 抗原導入人牙周膜成纖維細胞而獲得永生化特性。這種細胞系保留了正常人牙周膜成纖維細胞的部分生物學特性，同時具備無限增殖的能力，為牙周組織相關的研究提供了穩定的細胞模型。

在牙周組織工程領域，它們可用于研究牙周組織的再生機制，例如探索不同生物材料與成纖維細胞相互作用對牙周組織修復的影響。在藥物篩選方面，可用于測試新型藥物對牙周膜成纖維細胞生理功能（如增殖、遷移、分化等）的作用，從而為牙周疾病治療藥物的研發提供實驗依據。另外，對于研究牙周膜成纖維細胞在牙周炎等疾病發生發展過程中的細胞學變化和分子機制，該細胞系也具有重要的應用價值。

二、細胞培養前的準備工作

（一）培養設備與器材檢查

在開始細胞培養之前，需要對細胞培養所需的設備和器材進行全面的檢查。細胞培養箱是維持細胞生長環境的關鍵設備，應確保其溫度、濕度和 CO?濃度的控制精準且穩定。一般設定溫度為 37℃，濕度保持在 95% 左右，CO?濃度為 5%。檢查培養箱的水盤是否有足夠的水，以維持濕度；同時觀察培養箱內的溫度和 CO?濃度是否在設定范圍內，如有偏差及時進行校準。

顯微鏡是觀察細胞形態和生長狀態的重要工具，需檢查其目鏡和物鏡是否清潔，調節焦距的功能是否正常，以確保能夠清晰準確地觀察細胞的各種細節，如細胞的形態、大小、細胞核的狀態以及是否有污染等情況。

培養皿、離心管等耗材的質量也會影響細胞培養的結果。檢查培養皿的表面是否光滑、平整，有無劃痕、裂紋等缺陷；離心管是否密封良好，有無破損。使用前，所有耗材都應按照要求進行滅菌處理，一般采用高壓滅菌（121℃，15 - 20 分鐘）或使用無菌包裝的一次性耗材，以避免細菌、真菌等微生物污染細胞。

（二）培養基配制與滅菌

永生化人牙周膜成纖維細胞 - SV40 的培養基通常由基礎培養基和多種添加成分組成。常用的基礎培養基為 Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）或 Minimum Essential Medium（MEM）。這些基礎培養基提供了細胞生長所需的基本營養成分，包括碳水化合物、氨基酸、維生素等。

在基礎培養基的基礎上，需要添加適量的胎牛血清（FBS），一般添加比例為 10% - 15%。胎牛血清富含多種細胞生長因子、激素、黏附因子等，能夠促進細胞的生長和增殖，同時為細胞提供一個類似于體內環境的營養支持。此外，還需要加入青霉素 - 鏈霉素溶液（通常濃度為 100 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 鏈霉素），以防止細菌和真菌的污染。部分實驗室還會根據實驗需求添加其他成分，如胰島素、表皮生長因子等，以優化細胞的生長環境。

配制好的培養基需要進行滅菌處理，一般采用高壓蒸汽滅菌法。將培養基分裝到合適的容器中，設置壓力為 100 - 105 kPa，溫度為 121℃，滅菌 15 - 20 分鐘。在滅菌過程中，要注意防止培養基過度沸騰導致成分丟失或變性。滅菌完成后，將培養基調至 4℃保存，待使用前再恢復至室溫。

三、細胞復蘇的規范操作

從凍存狀態復蘇細胞是細胞培養的起始步驟，正確的操作可以保證細胞的活性和正常生長。首先，準備一個 37℃左右的水浴鍋，將含有凍存細胞的凍存管從液氮罐中迅速取出，立即放入水浴鍋中，并用鑷子快速搖動凍存管，使細胞在 1 - 2 分鐘內融化。快速融化可以盡量減少細胞在低溫到常溫過程中受到的損傷，提高細胞的復蘇率。

然后，用 75% 的酒精對凍存管外部進行消毒，避免外界細菌、真菌等微生物污染細胞。在無菌操作臺內，將凍存管內的細胞懸液快速加入到含有適量培養基的離心管中，輕輕吹打混勻，使細胞均勻分散在培養基中。接下來進行離心操作，一般設定離心速度為 1000 - 1200rpm，離心時間為 5 分鐘左右，使細胞沉淀到離心管底部。離心完成后，小心棄去上清液，注意不要倒掉沉淀的細胞。加入新鮮的培養基，用移液管輕輕吹打細胞沉淀，使其重新懸浮在培養基中。將細胞懸液轉移至培養皿中，輕輕晃動培養皿，使細胞均勻分布在整個培養皿表面，放入 37℃、5% CO?的細胞培養箱中靜置培養，讓細胞逐漸恢復活性并開始貼壁生長。

四、細胞培養過程中的觀察與記錄

定期觀察細胞的生長狀態是細胞培養過程中的重要環節。通常每天至少觀察一次細胞，觀察內容包括細胞的形態、顏色、細胞密度以及培養基的情況等。正常生長的永生化人牙周膜成纖維細胞 - SV40 細胞呈長梭形或多邊形，細胞邊緣清晰，胞質均勻，顏色為淡黃色或透明，細胞之間相互連接成網狀結構。當細胞生長良好時，細胞密度會逐漸增加，培養基的顏色可能會因為細胞代謝而略有變化，如由紅色逐漸變為橙色或淡黃色。

若觀察到細胞顏色變深、渾濁，或者出現大量漂浮物，則可能提示細胞受到細菌、真菌或支原體等微生物的污染，或者細胞已經死亡、變性。此時需要立即進行處理，如更換培養基、使用抗生素等，嚴重污染的細胞可能需要丟棄，防止污染擴散到其他細胞培養體系中。

同時，要詳細記錄細胞的生長情況，包括細胞的形態變化、細胞密度的估計值（如以細胞占據培養皿面積的百分比表示）、培養基的更換時間、細胞傳代的時間和比例等信息。這些記錄有助于了解細胞的生長規律，為后續實驗安排提供參考，也有助于在出現問題時追溯原因，及時調整培養條件或采取相應的解決措施。

五、細胞傳代的詳細步驟

當永生化人牙周膜成纖維細胞 - SV40 生長到培養皿面積的 80% - 90% 左右時，需要進行傳代操作，以避免細胞因密度過高而出現接觸抑制，影響細胞的正常生長和功能。

傳代前，先用磷酸鹽緩沖液（PBS）輕輕沖洗培養皿中的細胞，目的是去除細胞表面殘留的培養基和一些可能影響細胞傳代的雜質。沖洗時，將適量的 PBS 緩慢加入培養皿，輕輕晃動培養皿使 PBS 均勻覆蓋細胞表面，然后將 PBS 緩慢傾斜倒出，注意不要用力沖刷細胞，以免對細胞造成損傷。

接著，加入適量的胰蛋白酶 - EDTA 溶液（常用濃度為 0.25% 胰蛋白酶和 0.02% EDTA）到培養皿中，胰蛋白酶可以分解細胞間的黏附分子，使細胞從培養皿表面脫落。將培養皿放入 37℃、5% CO?的培養箱中孵育 1 - 2 分鐘，期間要不時在顯微鏡下觀察細胞是否開始脫落。若細胞未全脫落，可輕輕敲擊培養皿的側壁，幫助細胞脫離培養皿表面。當細胞大部分脫落形成細胞懸液后，立即加入適量的含血清培養基終止胰蛋白酶的作用，因為胰蛋白酶作用時間過長會對細胞造成損傷，影響細胞的活性和后續生長。

將細胞懸液轉移至離心管中，進行離心（條件同前），棄去上清液后，加入新鮮的培養基，用移液管輕輕吹打，使細胞均勻分散在培養基中。按照適當的比例（如 1:2 或 1:3）將細胞懸液分配到新的培養皿中，輕輕晃動培養皿使細胞均勻分布，放入培養箱繼續培養。傳代后的細胞需要特別關注前 24 小時的生長狀態，觀察細胞是否能夠正常貼壁、恢復生長，如有異常及時采取措施。

六、細胞凍存的標準化流程

對于多余的細胞或需要長期保存的細胞系，凍存是常用的保存方法。凍存前，先用胰蛋白酶消化細胞并收集細胞懸液，離心后棄去上清液。加入適量的凍存液（一般凍存液的成分為 90% 胎牛血清和 10% 二甲基亞砜（DMSO）），輕輕吹打使細胞均勻分散在凍存液中。將細胞懸液分裝至凍存管中，每管一般裝 1 - 1.5ml。然后將凍存管放入程序降溫盒中，使細胞緩慢降溫。如果沒有程序降溫盒，可采用手動降溫的方法：先將凍存管放置在 4℃環境下 30 分鐘，再轉移到 - 20℃環境下放置 1 - 2 小時，最后轉移到 - 80℃冰箱中保存 2 - 3 小時，之后迅速將凍存管轉移到液氮罐中長期保存。這種緩慢降溫的程序可以減少細胞內冰晶的形成，降低細胞在凍存過程中受到的損傷，提高細胞的復蘇率。

七、細胞實驗應用的操作要點

（一）基因轉染實驗操作

該細胞系常用于基因轉染實驗，以研究特定基因在細胞中的功能。在進行基因轉染前，要確保細胞處于良好的生長狀態，細胞密度在 70% - 80% 左右較為合適。對于質粒轉染，常用脂質體介導的轉染方法。首先，將質粒 DNA 和脂質體轉染試劑按照一定比例（如 1:2 或 1:3）在無血清培養基中混合，室溫孵育 15 - 30 分鐘，使脂質體與質粒形成轉染復合物。然后將轉染復合物加入到細胞培養皿中，輕輕晃動培養皿使復合物均勻分布。轉染后 6 - 8 小時，可更換為含有血清的培養基，以維持細胞的正常生長。一般在轉染后 24 - 72 小時，根據所轉染基因的特點和實驗需求，通過熒光顯微鏡觀察轉染效率（如果質粒攜帶熒光報告基因）或進行相關基因功能檢測實驗，如檢測基因表達水平（采用實時熒光定量 PCR 或 Western blot 等方法）或細胞生物學功能變化（如細胞增殖、遷移、分化等實驗）。

（二）細胞遷移實驗操作

永生化人牙周膜成纖維細胞 - SV40 在牙周組織的修復和再生過程中，其遷移能力是一個重要的生物學功能。細胞遷移實驗可用于研究影響細胞遷移的各種因素，如細胞外基質成分、細胞因子、藥物等。常用的細胞遷移實驗方法有劃痕實驗和 Transwell 小室實驗。

在劃痕實驗中，待細胞在培養皿中生長至接近 confluent（即細胞幾乎鋪滿培養皿表面）時，使用無菌的 10μl 移液槍頭或細胞刮刀在細胞層中央輕輕劃一條直線，制造一個細胞空白區域，即“劃痕”。用 PBS 小心沖洗培養皿，去除劃痕處脫落的細胞碎片，然后加入不含血清的培養基（因為血清中的某些成分可能會刺激細胞增殖，干擾遷移結果的判斷）。將培養皿放入培養箱中，在不同時間點（如 0 小時、6 小時、12 小時、24 小時等）取出培養皿，在顯微鏡下拍照記錄劃痕處細胞的遷移情況。通過測量劃痕寬度的變化或計算遷移細胞的數量，可以定量分析細胞的遷移能力。

Transwell 小室實驗則是在一個特殊的雙層培養裝置中進行。上層小室的底部鋪有一層聚碳酸酯膜，該膜上可以涂有或不涂有細胞外基質成分（如膠原蛋白、纖維連接蛋白等），以模擬體內細胞遷移的微環境。下層小室中加入含有一定濃度細胞因子或藥物的培養基作為化學趨向因子，吸引上層小室中的細胞向下游遷移。將永生化人牙周膜成纖維細胞 - SV40 種植到上層小室中，放入培養箱孵育一定時間（如 12 - 24 小時）。孵育結束后，用棉簽輕輕擦去上層小室表面未遷移的細胞，對遷移至下層小室或膜下表面的細胞進行固定、染色，然后在顯微鏡下計數。通過比較不同實驗組和對照組的遷移細胞數量，可以評估各種因素對細胞遷移的影響。

（三）細胞與材料相互作用實驗操作

在牙周組織工程研究中，研究細胞與生物材料的相互作用是一個關鍵環節。將永生化人牙周膜成纖維細胞 - SV40 種植到不同的生物材料表面（如羥基磷灰石、聚乳酸 - 羥基乙酸共聚物等），可以觀察細胞在材料表面的黏附、增殖、分化以及細胞外基質分泌等情況，從而評估材料的生物相容性和對牙周組織修復的支持作用。

在進行這類實驗時，首先需要對生物材料進行適當的處理和滅菌，確保材料表面清潔、無毒且適合細胞生長。將材料樣品放置在培養皿或細胞培養板中，然后將細胞以適當的密度接種到材料表面。在細胞培養箱中孵育一段時間后，通過掃描電子顯微鏡觀察細胞在材料表面的形態和分布情況，了解細胞與材料的初始黏附狀態。同時，可以采用一系列的細胞生物學檢測方法，如細胞計數試劑盒（CCK - 8）檢測細胞的增殖情況，阿爾辛藍染色檢測細胞外基質中糖胺聚糖的分泌量，免疫熒光染色檢測細胞骨架蛋白（如 F - actin）的排列和相關分化標志蛋白（如 collagen type I）的表達等，綜合評估細胞與材料之間的相互作用效果，進而優化生物材料的性能，為牙周組織工程的臨床應用提供實驗依據。