一、細(xì)胞特性與應(yīng)用價(jià)值

永生化小鼠成牙骨質(zhì)細(xì)胞是通過特定的基因操作或病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式，使小鼠成牙骨質(zhì)細(xì)胞獲得永生化特性的一種細(xì)胞系。這些細(xì)胞保留了正常成牙骨質(zhì)細(xì)胞的部分生物學(xué)功能，如分泌牙骨質(zhì)相關(guān)蛋白、參與牙周組織礦化等能力，同時(shí)具備無限增殖的特點(diǎn)，為牙周組織發(fā)育、礦化機(jī)制以及相關(guān)疾病的研究提供了穩(wěn)定且可持續(xù)的細(xì)胞模型。

在牙周組織工程領(lǐng)域，永生化小鼠成牙骨質(zhì)細(xì)胞可用于研究牙骨質(zhì)形成及修復(fù)的細(xì)胞和分子機(jī)制。通過模擬體內(nèi)微環(huán)境，觀察這些細(xì)胞在不同刺激因素下的行為變化，能夠深入了解牙骨質(zhì)細(xì)胞如何響應(yīng)外界信號并參與牙周組織的改建過程。此外，該細(xì)胞系還適用于藥物篩選實(shí)驗(yàn)，可用于測試新型藥物或生物材料對成牙骨質(zhì)細(xì)胞生理功能的影響，從而為牙周疾病治療藥物的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。同時(shí)，在基因功能研究方面，可利用該細(xì)胞系進(jìn)行基因敲除、過表達(dá)等操作，研究特定基因在成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化、增殖及礦化過程中的作用機(jī)制。

二、細(xì)胞培養(yǎng)前的準(zhǔn)備工作

（一）培養(yǎng)設(shè)備與器材檢查

細(xì)胞培養(yǎng)需要在嚴(yán)格的無菌環(huán)境下進(jìn)行，因此對培養(yǎng)設(shè)備和器材的檢查至關(guān)重要。細(xì)胞培養(yǎng)箱是維持細(xì)胞生長的關(guān)鍵設(shè)備，應(yīng)確保其溫度、濕度和 CO? 濃度的控制精準(zhǔn)且穩(wěn)定。一般設(shè)定溫度為 37℃，濕度保持在 95% 左右，CO?濃度為 5%。定期檢查培養(yǎng)箱的水盤是否有足夠的水，以維持濕度；同時(shí)觀察培養(yǎng)箱內(nèi)的溫度和 CO? 濃度是否在設(shè)定范圍內(nèi)，如有偏差及時(shí)進(jìn)行校準(zhǔn)。

顯微鏡是觀察細(xì)胞形態(tài)和生長狀態(tài)的重要工具，需檢查其目鏡和物鏡是否清潔，調(diào)節(jié)焦距的功能是否正常，以確保能夠清晰準(zhǔn)確地觀察細(xì)胞的各種細(xì)節(jié)，如細(xì)胞的形態(tài)、大小、細(xì)胞核的狀態(tài)以及是否有污染等情況。

培養(yǎng)皿、離心管等耗材的質(zhì)量也會(huì)影響細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果。檢查培養(yǎng)皿的表面是否光滑、平整，有無劃痕、裂紋等缺陷；離心管是否密封良好，有無破損。使用前，所有耗材都應(yīng)按照要求進(jìn)行滅菌處理，一般采用高壓滅菌（121℃，15 - 20 分鐘）或使用無菌包裝的一次性耗材，以避免細(xì)菌、真菌等微生物污染細(xì)胞。

（二）培養(yǎng)基配制與滅菌

永生化小鼠成牙骨質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基通常由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和多種添加成分組成。常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為 α - Minimum Essential Medium（α - MEM）或 Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）。這些基礎(chǔ)培養(yǎng)基提供了細(xì)胞生長所需的基本營養(yǎng)成分，包括碳水化合物、氨基酸、維生素等。

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，需要添加適量的胎牛血清（FBS），一般添加比例為 10% - 15%。胎牛血清富含多種細(xì)胞生長因子、激素、黏附因子等，能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長和增殖，同時(shí)為細(xì)胞提供一個(gè)類似于體內(nèi)環(huán)境的營養(yǎng)支持。此外，還需要加入青霉素 - 鏈霉素溶液（通常濃度為 100 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 鏈霉素），以防止細(xì)菌和真菌的污染。部分實(shí)驗(yàn)室還會(huì)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求添加其他成分，如 β - 甘油磷酸鈉（用于促進(jìn)礦化）、抗壞血酸（促進(jìn)膠原合成）等，以優(yōu)化細(xì)胞的生長和分化環(huán)境。

配制好的培養(yǎng)基需要進(jìn)行滅菌處理，一般采用高壓蒸汽滅菌法。將培養(yǎng)基分裝到合適的容器中，設(shè)置壓力為 100 - 105 kPa，溫度為 121℃，滅菌 15 - 20 分鐘。在滅菌過程中，要注意防止培養(yǎng)基過度沸騰導(dǎo)致成分丟失或變性。滅菌完成后，將培養(yǎng)基調(diào)至 4℃保存，待使用前再恢復(fù)至室溫。

三、細(xì)胞復(fù)蘇的規(guī)范操作

從凍存狀態(tài)復(fù)蘇細(xì)胞是細(xì)胞培養(yǎng)的起始步驟，正確的操作可以保證細(xì)胞的活性和正常生長。首先，準(zhǔn)備一個(gè) 37℃左右的水浴鍋，將含有凍存細(xì)胞的凍存管從液氮罐中迅速取出，立即放入水浴鍋中，并用鑷子快速搖動(dòng)凍存管，使細(xì)胞在 1 - 2 分鐘內(nèi)全融化。快速融化可以盡量減少細(xì)胞在低溫到常溫過程中受到的損傷，提高細(xì)胞的復(fù)蘇率。

然后，用 75% 的酒精對凍存管外部進(jìn)行消毒，避免外界細(xì)菌、真菌等微生物污染細(xì)胞。在無菌操作臺(tái)內(nèi)，將凍存管內(nèi)的細(xì)胞懸液快速加入到含有適量培養(yǎng)基的離心管中，輕輕吹打混勻，使細(xì)胞均勻分散在培養(yǎng)基中。接下來進(jìn)行離心操作，一般設(shè)定離心速度為 1000 - 1200rpm，離心時(shí)間為 5 分鐘左右，使細(xì)胞沉淀到離心管底部。離心完成后，小心棄去上清液，注意不要倒掉沉淀的細(xì)胞。加入新鮮的培養(yǎng)基，用移液管輕輕吹打細(xì)胞沉淀，使其重新懸浮在培養(yǎng)基中。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿，使細(xì)胞均勻分布在整個(gè)培養(yǎng)皿表面，放入 37℃、5% CO? 的細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，讓細(xì)胞逐漸恢復(fù)活性并開始貼壁生長。

四、細(xì)胞培養(yǎng)過程中的觀察與記錄

定期觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)是細(xì)胞培養(yǎng)過程中的重要環(huán)節(jié)。通常每天至少觀察一次細(xì)胞，觀察內(nèi)容包括細(xì)胞的形態(tài)、顏色、細(xì)胞密度以及培養(yǎng)基的情況等。正常生長的永生化小鼠成牙骨質(zhì)細(xì)胞呈長梭形或不規(guī)則形，細(xì)胞邊緣清晰，胞質(zhì)均勻，顏色為淡黃色或透明，細(xì)胞之間相互連接成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。當(dāng)細(xì)胞生長良好時(shí)，細(xì)胞密度會(huì)逐漸增加，培養(yǎng)基的顏色可能會(huì)因?yàn)榧?xì)胞代謝而略有變化，如由紅色逐漸變?yōu)槌壬虻S色。

若觀察到細(xì)胞顏色變深、渾濁，或者出現(xiàn)大量漂浮物，則可能提示細(xì)胞受到細(xì)菌、真菌或支原體等微生物的污染，或者細(xì)胞已經(jīng)死亡、變性。此時(shí)需要立即進(jìn)行處理，如更換培養(yǎng)基、使用抗生素等，嚴(yán)重污染的細(xì)胞可能需要丟棄，防止污染擴(kuò)散到其他細(xì)胞培養(yǎng)體系中。

同時(shí)，要詳細(xì)記錄細(xì)胞的生長情況，包括細(xì)胞的形態(tài)變化、細(xì)胞密度的估計(jì)值（如以細(xì)胞占據(jù)培養(yǎng)皿面積的百分比表示）、培養(yǎng)基的更換時(shí)間、細(xì)胞傳代的時(shí)間和比例等信息。這些記錄有助于了解細(xì)胞的生長規(guī)律，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)安排提供參考，也有助于在出現(xiàn)問題時(shí)追溯原因，及時(shí)調(diào)整培養(yǎng)條件或采取相應(yīng)的解決措施。

五、細(xì)胞傳代的詳細(xì)步驟

當(dāng)永生化小鼠成牙骨質(zhì)細(xì)胞生長到培養(yǎng)皿面積的 80% - 90% 左右時(shí)，需要進(jìn)行傳代操作，以避免細(xì)胞因密度過高而出現(xiàn)接觸抑制，影響細(xì)胞的正常生長和功能。

傳代前，先用磷酸鹽緩沖液（PBS）輕輕沖洗培養(yǎng)皿中的細(xì)胞，目的是去除細(xì)胞表面殘留的培養(yǎng)基和一些可能影響細(xì)胞傳代的雜質(zhì)。沖洗時(shí)，將適量的 PBS 緩慢加入培養(yǎng)皿，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿使 PBS 均勻覆蓋細(xì)胞表面，然后將 PBS 緩慢傾斜倒出，注意不要用力沖刷細(xì)胞，以免對細(xì)胞造成損傷。

接著，加入適量的胰蛋白酶 - EDTA 溶液（常用濃度為 0.25% 胰蛋白酶和 0.02% EDTA）到培養(yǎng)皿中，胰蛋白酶可以分解細(xì)胞間的黏附分子，使細(xì)胞從培養(yǎng)皿表面脫落。將培養(yǎng)皿放入 37℃、5% CO? 的培養(yǎng)箱中孵育 1 - 2 分鐘，期間要不時(shí)在顯微鏡下觀察細(xì)胞是否開始脫落。若細(xì)胞未全脫落，可輕輕敲擊培養(yǎng)皿的側(cè)壁，幫助細(xì)胞脫離培養(yǎng)皿表面。當(dāng)細(xì)胞大部分脫落形成細(xì)胞懸液后，立即加入適量的含血清培養(yǎng)基終止胰蛋白酶的作用，因?yàn)橐鹊鞍酌缸饔脮r(shí)間過長會(huì)對細(xì)胞造成損傷，影響細(xì)胞的活性和后續(xù)生長。

將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，進(jìn)行離心（條件同前），棄去上清液后，加入新鮮的培養(yǎng)基，用移液管輕輕吹打，使細(xì)胞均勻分散在培養(yǎng)基中。按照適當(dāng)?shù)谋壤ㄈ?1:2 或 1:3）將細(xì)胞懸液分配到新的培養(yǎng)皿中，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿使細(xì)胞均勻分布，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。傳代后的細(xì)胞需要特別關(guān)注前 24 小時(shí)的生長狀態(tài)，觀察細(xì)胞是否能夠正常貼壁、恢復(fù)生長，如有異常及時(shí)采取措施。

六、細(xì)胞凍存的標(biāo)準(zhǔn)化流程

對于多余的細(xì)胞或需要長期保存的細(xì)胞系，凍存是常用的保存方法。凍存前，先用胰蛋白酶消化細(xì)胞并收集細(xì)胞懸液，離心后棄去上清液。加入適量的凍存液（一般凍存液的成分為 90% 胎牛血清和 10% 二甲基亞砜（DMSO）），輕輕吹打使細(xì)胞均勻分散在凍存液中。將細(xì)胞懸液分裝至凍存管中，每管一般裝 1 - 1.5ml。然后將凍存管放入程序降溫盒中，使細(xì)胞緩慢降溫。如果沒有程序降溫盒，可采用手動(dòng)降溫的方法：先將凍存管放置在 4℃環(huán)境下 30 分鐘，再轉(zhuǎn)移到 - 20℃環(huán)境下放置 1 - 2 小時(shí)，最后轉(zhuǎn)移到 - 80℃冰箱中保存 2 - 3 小時(shí)，之后迅速將凍存管轉(zhuǎn)移到液氮罐中長期保存。這種緩慢降溫的程序可以減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，降低細(xì)胞在凍存過程中受到的損傷，提高細(xì)胞的復(fù)蘇率。

七、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的操作要點(diǎn)

（一）礦化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)操作

永生化小鼠成牙骨質(zhì)細(xì)胞在牙周組織礦化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，礦化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)可用于研究細(xì)胞的礦化能力以及影響礦化的各種因素。在進(jìn)行礦化誘導(dǎo)前，將細(xì)胞以適當(dāng)密度接種到培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁后，更換為礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)基。礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)基通常在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加 β - 甘油磷酸鈉（終濃度一般為 10 mM 左右）、抗壞血酸（終濃度一般為 50 μg/ml 左右）和地塞米松（終濃度一般為 1 μM 左右）等誘導(dǎo)因子。 β - 甘油磷酸鈉可提供礦化所需的磷酸鹽，抗壞血酸促進(jìn)膠原合成，地塞米松則調(diào)節(jié)細(xì)胞的礦化相關(guān)基因表達(dá)。

在礦化誘導(dǎo)過程中，定期更換誘導(dǎo)培養(yǎng)基（一般每 2 - 3 天更換一次），同時(shí)觀察細(xì)胞形態(tài)的變化以及檢測礦化相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)情況。可以通過茜素紅染色檢測細(xì)胞外基質(zhì)的礦化沉積情況。茜素紅是一種鈣鹽染料，能夠與礦化結(jié)節(jié)中的鈣鹽結(jié)合形成紅色的復(fù)合物。在礦化誘導(dǎo)一定時(shí)間（如 14 - 21 天）后，用PBS輕輕沖洗細(xì)胞，加入適量的茜素紅染液（一般濃度為 0.1% - 0.2%），在室溫下染色 10 - 15 分鐘。然后用去離子水沖洗掉未結(jié)合的染液，觀察并拍照記錄礦化結(jié)節(jié)的形成情況。通過比較不同實(shí)驗(yàn)組和對照組的茜素紅染色結(jié)果，可以評估礦化誘導(dǎo)的效果以及各種因素對細(xì)胞礦化能力的影響。

（二）細(xì)胞因子分泌檢測實(shí)驗(yàn)操作

成牙骨質(zhì)細(xì)胞在牙周組織生理和病理過程中會(huì)分泌多種細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子在調(diào)節(jié)細(xì)胞行為、免疫反應(yīng)等方面起著重要作用。通過檢測永生化小鼠成牙骨質(zhì)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，可以深入了解其在不同刺激條件下的功能狀態(tài)。常用的細(xì)胞因子檢測方法包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）和蛋白質(zhì)芯片等。

在進(jìn)行 ELISA 檢測時(shí)，首先根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇合適的細(xì)胞因子檢測試劑盒，如檢測小鼠 RANKL（核因子 - κB 受體活化因子配體）或 OPG（骨保護(hù)素）等與骨代謝相關(guān)的細(xì)胞因子。將永生化小鼠成牙骨質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)至一定密度后，用不含血清的培養(yǎng)基孵育細(xì)胞一段時(shí)間（如 24 - 48 小時(shí)），收集上清液作為待測樣本。按照試劑盒說明書的操作步驟，將樣本加入到預(yù)先包被有特異性抗體的酶標(biāo)板孔中，經(jīng)過孵育、洗滌、加入酶標(biāo)記二抗、顯色反應(yīng)等步驟，最后通過酶標(biāo)儀測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出細(xì)胞因子在樣本中的濃度。通過比較不同處理組和對照組的細(xì)胞因子分泌水平，可以分析各種因素（如藥物、炎癥因子等）對成牙骨質(zhì)細(xì)胞分泌功能的影響，從而探討其在牙周組織疾病發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。

（三）細(xì)胞與材料相互作用實(shí)驗(yàn)操作

在牙周組織工程研究中，研究細(xì)胞與生物材料的相互作用是一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。將永生化小鼠成牙骨質(zhì)細(xì)胞種植到不同的生物材料表面（如羥基磷灰石、生物活性陶瓷等），可以觀察細(xì)胞在材料表面的黏附、增殖、分化以及細(xì)胞外基質(zhì)分泌等情況，從而評估材料的生物相容性和對牙周組織修復(fù)的支持作用。

在進(jìn)行這類實(shí)驗(yàn)時(shí)，首先需要對生物材料進(jìn)行適當(dāng)?shù)奶幚砗蜏缇_保材料表面清潔、無毒且適合細(xì)胞生長。將材料樣品放置在培養(yǎng)皿或細(xì)胞培養(yǎng)板中，然后將細(xì)胞以適當(dāng)?shù)拿芏冉臃N到材料表面。在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育一段時(shí)間后，通過掃描電子顯微鏡觀察細(xì)胞在材料表面的形態(tài)和分布情況，了解細(xì)胞與材料的初始黏附狀態(tài)。同時(shí)，可以采用一系列的細(xì)胞生物學(xué)檢測方法，如細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK - 8）檢測細(xì)胞的增殖情況，阿爾辛藍(lán)染色檢測細(xì)胞外基質(zhì)中糖胺聚糖的分泌量，免疫熒光染色檢測細(xì)胞骨架蛋白（如 F - actin）的排列和相關(guān)分化標(biāo)志蛋白（如 collagen type I）的表達(dá)等，綜合評估細(xì)胞與材料之間的相互作用效果，進(jìn)而優(yōu)化生物材料的性能，為牙周組織工程的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。