一、細胞特性與應用價值

永生化大鼠門靜脈肌成纖維細胞（RGF）是經(jīng)基因工程改造后獲得永生化特性的細胞系。這些細胞不僅保留了正常肌成纖維細胞的收縮、分泌等基礎功能，還具備持續(xù)增殖能力，為肝臟疾病研究等提供穩(wěn)定細胞模型。在肝臟纖維化與再生領域，RGF細胞可用于探究肌成纖維細胞激活及參與組織修復機制，助力了解肝臟損傷后的病理生理變化。同時，它們也是藥物篩選與毒性測試的優(yōu)質體外模型，能快速評估藥物對肌成纖維細胞生理功能的影響，為肝臟疾病藥物研發(fā)提供實驗依據(jù)。

二、細胞培養(yǎng)前的準備工作

（一）培養(yǎng)設備與器材檢查

在進行細胞培養(yǎng)之前，對培養(yǎng)設備和器材進行全面檢查是確保實驗順利進行的關鍵步驟。首先檢查細胞培養(yǎng)箱，確認其溫度、濕度和 CO? 濃度的控制系統(tǒng)是否正常。一般來說，細胞培養(yǎng)箱的溫度應精準維持在 37℃，濕度需保持在 95% 左右，而 CO? 濃度則應穩(wěn)定在 5%。這三個參數(shù)對于模擬細胞在體內(nèi)的生長環(huán)境至關重要。如果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)箱的任何參數(shù)出現(xiàn)偏差，應立即進行校準或維修，以確保細胞能夠在適宜的環(huán)境中生長。

顯微鏡是觀察細胞形態(tài)和生長狀態(tài)的工具。檢查顯微鏡的目鏡和物鏡是否清潔無污，調(diào)節(jié)焦距的裝置是否靈活有效。只有通過清潔且功能正常的顯微鏡，才能清晰準確地觀察到細胞的細微結構，如細胞核的形狀、細胞質的分布以及細胞間的連接情況等，從而及時發(fā)現(xiàn)細胞生長過程中的異常變化。此外，還需檢查培養(yǎng)皿、離心管等耗材的質量。確保培養(yǎng)皿表面平整光滑、無劃痕、無裂紋，離心管密封性能良好、無破損。使用前，對所有耗材進行高壓滅菌處理（121℃，15 - 20 分鐘）或直接使用無菌包裝的一次性耗材，以防止細菌、真菌等微生物污染細胞，影響實驗結果。

（二）培養(yǎng)基配制與滅菌

配制適合 RGF 細胞生長的培養(yǎng)基是細胞培養(yǎng)成功的另一個關鍵因素。基礎培養(yǎng)基通常選擇 Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM），這些培養(yǎng)基含有細胞生長所需的基本營養(yǎng)成分，如碳水化合物、氨基酸和維生素等。除了基礎培養(yǎng)基外，還需添加 10% - 15% 的胎牛血清（FBS），胎牛血清富含多種細胞生長因子、激素和黏附因子，能夠為細胞提供豐富的營養(yǎng)支持，促進細胞的生長和增殖。同時，加入青霉素 - 鏈霉素溶液（100 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 鏈霉素）以防止細菌和真菌的污染。

配制好的培養(yǎng)基需要進行高壓蒸汽滅菌處理。將培養(yǎng)基分裝到合適的容器中，設置壓力為 100 - 105 kPa，溫度為 121℃，滅菌 15 - 20 分鐘。在滅菌過程中，要確保培養(yǎng)基不過度沸騰，以免造成成分的丟失或變性。滅菌完成后，將培養(yǎng)基調(diào)至 4℃保存，待使用前再恢復至室溫，以保持培養(yǎng)基中各種成分的穩(wěn)定性和活性。

三、細胞復蘇的規(guī)范操作

從凍存狀態(tài)復蘇 RGF 細胞是細胞培養(yǎng)的起始步驟，正確的操作可以確保細胞的活性和正常生長。首先，準備一個 37℃左右的水浴鍋，將含有凍存細胞的凍存管從液氮罐中迅速取出，立即放入水浴鍋中，并用鑷子快速搖動凍存管，使細胞在 1 - 2 分鐘內(nèi)全融化。快速融化可以最大限度地減少細胞在低溫到常溫過程中受到的損傷，提高細胞的復蘇率。

然后，用 75% 的酒精對凍存管外部進行消毒，以防止外界細菌、真菌等微生物污染細胞。在無菌操作臺內(nèi)，將凍存管內(nèi)的細胞懸液快速加入到含有適量培養(yǎng)基的離心管中，輕輕吹打混勻，使細胞均勻分散在培養(yǎng)基中。接下來進行離心操作，一般設定離心速度為 1000 - 1200rpm，離心時間為 5 分鐘左右，使細胞沉淀到離心管底部。離心完成后，小心棄去上清液，注意不要倒掉沉淀的細胞。加入新鮮的培養(yǎng)基，用移液管輕輕吹打細胞沉淀，使其重新懸浮在培養(yǎng)基中。將細胞懸液轉移至培養(yǎng)皿中，輕輕晃動培養(yǎng)皿，使細胞均勻分布在整個培養(yǎng)皿表面，放入 37℃、5% CO? 的細胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，讓細胞逐漸恢復活性并開始貼壁生長。在復蘇后的 24 小時內(nèi)，要密切觀察細胞的生長狀態(tài)，及時更換培養(yǎng)基，以確保細胞能夠順利適應新的培養(yǎng)環(huán)境。

四、細胞培養(yǎng)過程中的觀察與記錄

定期觀察 RGF 細胞的生長狀態(tài)是細胞培養(yǎng)過程中的重要環(huán)節(jié)。通常每天至少觀察一次細胞，觀察內(nèi)容包括細胞的形態(tài)、顏色、細胞密度以及培養(yǎng)基的情況等。正常生長的 RGF 細胞呈梭形或紡錘形，細胞邊緣清晰，胞質均勻，顏色為淡黃色或透明，細胞之間相互連接成網(wǎng)狀結構。當細胞生長良好時，細胞密度會逐漸增加，培養(yǎng)基的顏色可能會因為細胞代謝而略有變化，如由紅色逐漸變?yōu)槌壬虻S色。

若觀察到細胞顏色變深、渾濁，或者出現(xiàn)大量漂浮物，則可能提示細胞受到細菌、真菌或支原體等微生物的污染，或者細胞已經(jīng)死亡、變性。此時需要立即進行處理，如更換培養(yǎng)基、使用抗生素等，嚴重污染的細胞可能需要丟棄，以防止污染擴散到其他細胞培養(yǎng)體系中。

同時，要詳細記錄細胞的生長情況，包括細胞的形態(tài)變化、細胞密度的估計值（如以細胞占據(jù)培養(yǎng)皿面積的百分比表示）、培養(yǎng)基的更換時間、細胞傳代的時間和比例等信息。這些記錄有助于了解細胞的生長規(guī)律，為后續(xù)實驗安排提供參考，也有助于在出現(xiàn)問題時追溯原因，及時調(diào)整培養(yǎng)條件或采取相應的解決措施。例如，通過觀察細胞在不同培養(yǎng)基成分下的生長情況，可以優(yōu)化培養(yǎng)基配方，提高細胞的生長質量和實驗重復性。

五、細胞傳代的詳細步驟

當 RGF 細胞生長到培養(yǎng)皿面積的 80% - 90% 左右時，需要進行傳代操作，以避免細胞因密度過高而出現(xiàn)接觸抑制，影響細胞的正常生長和功能。傳代前，先用磷酸鹽緩沖液（PBS）輕輕沖洗培養(yǎng)皿中的細胞，目的是去除細胞表面殘留的培養(yǎng)基和一些可能影響細胞傳代的雜質。沖洗時，將適量的 PBS 緩慢加入培養(yǎng)皿，輕輕晃動培養(yǎng)皿使 PBS 均勻覆蓋細胞表面，然后將 PBS 緩慢傾斜倒出，注意不要用力沖刷細胞，以免對細胞造成損傷。

接著，加入適量的胰蛋白酶 - EDTA 溶液（常用濃度為 0.25% 胰蛋白酶和 0.02% EDTA）到培養(yǎng)皿中，胰蛋白酶可以分解細胞間的黏附分子，使細胞從培養(yǎng)皿表面脫落。將培養(yǎng)皿放入 37℃、5% CO? 的培養(yǎng)箱中孵育 1 - 2 分鐘，期間要不時在顯微鏡下觀察細胞是否開始脫落。若細胞未全脫落，可輕輕敲擊培養(yǎng)皿的側壁，幫助細胞脫離培養(yǎng)皿表面。當細胞大部分脫落形成細胞懸液后，立即加入適量的含血清培養(yǎng)基終止胰蛋白酶的作用，因為胰蛋白酶作用時間過長會對細胞造成損傷，影響細胞的活性和后續(xù)生長。

將細胞懸液轉移至離心管中，進行離心（條件同前），棄去上清液后，加入新鮮的培養(yǎng)基，用移液管輕輕吹打，使細胞均勻分散在培養(yǎng)基中。按照適當?shù)谋壤ㄈ?1:2 或 1:3）將細胞懸液分配到新的培養(yǎng)皿中，輕輕晃動培養(yǎng)皿使細胞均勻分布，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。傳代后的細胞需要特別關注前 24 小時的生長狀態(tài)，觀察細胞是否能夠正常貼壁、恢復生長，如有異常及時采取措施，如調(diào)整培養(yǎng)基成分、優(yōu)化培養(yǎng)條件等，以確保細胞的健康生長和實驗的順利進行。

六、細胞凍存的標準化流程

對于多余的細胞或需要長期保存的細胞系，凍存是常用的保存方法。凍存前，先用胰蛋白酶消化細胞并收集細胞懸液，離心后棄去上清液。加入適量的凍存液（一般凍存液的成分為 90% 胎牛血清和 10% 二甲基亞砜（DMSO）），輕輕吹打使細胞均勻分散在凍存液中。將細胞懸液分裝至凍存管中，每管一般裝 1 - 1.5ml。然后將凍存管放入程序降溫盒中，使細胞緩慢降溫。如果沒有程序降溫盒，可采用手動降溫的方法：先將凍存管放置在 4℃環(huán)境下 30 分鐘，再轉移到 - 20℃環(huán)境下放置 1 - 2 小時，最后轉移到 - 80℃冰箱中保存 2 - 3 小時，之后迅速將凍存管轉移到液氮罐中長期保存。這種緩慢降溫的程序可以減少細胞內(nèi)冰晶的形成，降低細胞在凍存過程中受到的損傷，提高細胞的復蘇率。在凍存過程中，要注意保持凍存管的密封性，防止水分進入導致細胞受損，同時做好凍存管的標記，注明細胞名稱、凍存日期等信息，以便后續(xù)使用時能夠快速準確地找到所需的細胞。

七、細胞實驗應用的操作要點

（一）細胞遷移與侵襲實驗操作

RGF 細胞在肝臟纖維化等病理過程中涉及細胞遷移和侵襲行為。細胞遷移與侵襲實驗可用于研究影響細胞運動能力的各種因素。常用的實驗方法有 Transwell 小室實驗和劃痕實驗。

在 Transwell 小室實驗中，上層小室的底部鋪有一層聚碳酸酯膜，該膜上可以涂有或不涂有細胞外基質成分（如膠原蛋白、纖維連接蛋白等），以模擬體內(nèi)細胞遷移的微環(huán)境。下層小室中加入含有一定濃度細胞因子或藥物的培養(yǎng)基作為化學趨向因子，吸引上層小室中的細胞向下游遷移或侵襲。將 RGF 細胞種植到上層小室中，放入培養(yǎng)箱孵育一定時間（如 12 - 24 小時）。孵育結束后，用棉簽輕輕擦去上層小室表面未遷移或侵襲的細胞，對遷移或侵襲至下層小室或膜下表面的細胞進行固定、染色，然后在顯微鏡下計數(shù)。通過比較不同實驗組和對照組的遷移或侵襲細胞數(shù)量，可以評估各種因素對細胞運動能力的影響。

劃痕實驗則是在細胞鋪滿培養(yǎng)皿后，用無菌的細尖頭物在細胞層上劃痕，制造出細胞空白區(qū)域。隨后用 PBS 輕洗，去除劃痕邊緣的懸浮細胞。將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中孵育，不同時間點取出觀察并拍照，記錄細胞遷移填補劃痕的情況。通過測量劃痕寬度的變化或計算遷移細胞的數(shù)量，可以定量分析細胞的遷移能力。

（二）細胞因子分泌檢測實驗操作

RGF 細胞會分泌多種細胞因子，在調(diào)節(jié)細胞行為、免疫反應等方面起著重要作用。通過檢測 RGF 細胞分泌的細胞因子，可以深入了解其在不同刺激條件下的功能狀態(tài)。常用的細胞因子檢測方法包括酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）和蛋白質芯片等。

在進行 ELISA 檢測時，首先根據(jù)實驗需求選擇合適的細胞因子檢測試劑盒，如檢測大鼠 TGF - β（轉化生長因子 - β）或 PDGF（血小板衍生生長因子）等細胞因子。將 RGF 細胞培養(yǎng)至一定密度后，用不含血清的培養(yǎng)基孵育細胞一段時間（如 24 - 48 小時），收集上清液作為待測樣本。按照試劑盒說明書的操作步驟，將樣本加入到預先包被有特異性抗體的酶標板孔中，經(jīng)過孵育、洗滌、加入酶標記二抗、顯色反應等步驟，最后通過酶標儀測定吸光度值，根據(jù)標準曲線計算出細胞因子在樣本中的濃度。通過比較不同處理組和對照組的細胞因子分泌水平，可以分析各種因素（如藥物、炎癥因子等）對 RGF 細胞分泌功能的影響，從而探討其在肝臟疾病發(fā)生發(fā)展中的作用機制，為開發(fā)新的治療策略提供線索。

（三）細胞與材料相互作用實驗操作

在組織工程研究中，研究 RGF 細胞與生物材料的相互作用是一個關鍵環(huán)節(jié)。將 RGF 細胞種植到不同的生物材料表面（如生物可降解材料、組織工程支架等），可以觀察細胞在材料表面的黏附、增殖、分化以及細胞外基質分泌等情況，從而評估材料的生物相容性和對組織修復的支持作用。

在進行這類實驗時，首先需要對生物材料進行適當?shù)奶幚砗蜏缇_保材料表面清潔、無毒且適合細胞生長。將材料樣品放置在培養(yǎng)皿或細胞培養(yǎng)板中，然后將細胞以適當?shù)拿芏冉臃N到材料表面。在細胞培養(yǎng)箱中孵育一段時間后，通過掃描電子顯微鏡觀察細胞在材料表面的形態(tài)和分布情況，了解細胞與材料的初始黏附狀態(tài)。同時，可以采用一系列的細胞生物學檢測方法，如細胞計數(shù)試劑盒（CCK - 8）檢測細胞的增殖情況，免疫熒光染色檢測細胞骨架蛋白（如 F - actin）的排列和相關分化標志蛋白的表達等，綜合評估細胞與材料之間的相互作用效果。通過這些實驗，可以篩選出適合組織工程應用的生物材料，優(yōu)化材料的表面特性或組成，以提高細胞的活性和功能，加速組織的修復和再生過程。