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惰性聯苯柱在類固醇及其 Ⅱ 相代謝物分析中的應用
前言 Restek LC
目前，不銹鋼是市面上制造液相色譜柱柱管的首_選材料，相比玻璃，聚合物以及鈦合金，不銹鋼具有優秀的耐壓性和機械強度，較高的化學穩定性和耐腐蝕性，易于加工制造成型且成本效益高，是一位綜合素質很高的六邊形戰士。
不過，六邊形戰士遇到了一個令人撓頭的問題，當分析一些極性化合物時，比如含硫或者含氮化合物，分析物與不銹鋼表面經常會發生非特異性吸附（NSA），這種吸附會引發一系列不良后果，比如峰形拖尾、回收率降低，甚至會對整體的分離效果產生顯著的影響。
01
非特異性吸附與惰性硬件
RESTEK LC
圖 A：常規 316 不銹鋼柱表面為厚度約為 2 nm 的富 Cr 氧化物層；該金屬氧化物層的等電點（IEP）為 7，在酸性色譜條件下，部分活性位點與待測物發生金屬螯合作用，是非特異性吸附的根本原因。
Restek 敏銳地發現了這一問題，并推出了可以解決非特異性吸附的 Inert 惰性液相柱。Inert 惰性液相柱 采用化學氣相沉積（CVD）技術對柱管內表面進行處理，即在柱管內壁形成有機-無機雜化涂層，隔絕了待測物與金屬表面的相互作用，為色譜柱提供了良好的惰性。
圖 B：惰性液相色譜柱的內壁經過化學改性，其表面為有機-無機混合涂層（500 nm），從而防止了金屬與分析物之間的相互作用。
02
柱管的影響及數據分析
RESTEK
在本次的液相柱性能對比研究中，我們采用聯苯柱分析類固醇及其 II 相代謝物。聯苯與 C18 的選擇性有很大的不同， 由于苯環提供的 π-π 作用以及空間結構的識別能力，使得聯苯柱特別擅長分離芳香化合物及其同分異構體；與未經惰性處理的常規液相柱相比，惰性柱提供了更好的峰形和更高的響應。
實驗結果證明，使用帶惰性涂層的液相柱可以減輕非特異吸附（NSA），不需要重復進樣或在流動相中添加可能降低系統靈敏度的試劑，就可以獲得穩定的色譜性能。
目標化合物：
分析條件 (Acquity H-Class UPLC+ Waters XevoTQ-XS ) | |
分析柱 | 1. X品牌常規液相柱：Biphenyl 1.7μm, 100 mm x 2.1 mm 2. Raptor Biphenyl 1.8μm, 100 x 2.1 mm (Restek 常規不銹鋼柱，貨號：9309212) 3. Raptor Inert Biphenyl 1.8μm, 100 mm x 2.1 mm (Restek 惰性液相柱，貨號：9309212-T) |
流動相 A | 水（0.01% 甲酸） |
流動相 B | 甲醇（0.01% 甲酸） |
洗脫梯度 | 時間 (min) | %B |
0.00 | 40 | |
18.00 | 100 | |
18.01 | 40 | |
24.00 | 40 |
流速 | 0.4 mL / min |
進樣量 | 5 µL （稀釋液為水:甲醇= 1:1 v/v） |
柱溫 | 60°C |
離子化 和掃描模式 | ESI + &ESI-， MRM |
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03
結果對比: 常規保護柱 vs 惰性保護柱
RESTEK
下表展示了常規分析柱、常規保護柱、惰性分析柱、惰性保護柱在 4 種組合使用方式下，標準品（A）和從血漿（B）中提取的硫酸脫氫表雄酮（100 ng/mL）的半峰寬，對稱因子和峰高的比較，實驗證明，惰性保護柱與惰性分析柱的組合表現最好。
保護柱/分析柱，I 代表惰性，C 代表常規
04
為什么選擇聯苯固定相
RESTEK
聯苯固定相與待測物之間的 π-π 作用和空間結構識別能力，為異構體提供了良好的分離。使用經優化的色譜方法獲得的一些關鍵類固醇（異構體）的 MRM 圖如下：
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05
類固醇種類擴展分析
RESTEK
使用在惰性聯苯柱上建立的分析方法，從六名健康志愿者的混合血漿樣本中檢測到 52 種類固醇。
上圖為 MRM 圖，下圖的橫坐標為 RT（min），縱坐標為母離子（m/z）,每個圓的面積與對應峰強度成正比。
惰性柱有助于提高類固醇及其 II 相代謝物的分辨率，實現準確定量（特別是硫酸化代謝物在常規柱分析中容易發生色譜峰拖尾，特征離子在高豐度的情況下也會面臨離子抑制，從而造成定量的不準確）。
06
研究總結
RESTEK
1
LC-MS 分析類固醇的 II 相代謝物過程中，液相柱柱管內壁的非特異性吸附會對分析結果產生顯著的不良影響。
2
對于所有硫酸化和葡萄糖醛酸化的類固醇，使用未經鈍化處理的液相柱，會產生明顯的非特異性吸附，并導致峰展寬。為了消除這種負面作用，嘗試在流動相中加入甲酸銨，但是導致了保留時間的改變和 MS 靈敏度的降低。
3
惰性柱避免了這一問題，使類固醇 II 相代謝物分析更準確。
4
聯苯固定相與待測物之間的 π-π 作用和空間結構識別能力，為異構體提供了良好的分離。
5
新建立的分析方法在復雜的生物基質（人血漿）中得到了驗證，其中 II 相代謝物與數百種其他類固醇化合物一起進行了分析，證明了惰性柱分析類固醇及其代謝物具有明顯優勢。
07
Restek Inert 惰性液相柱選擇指南
RESTEK
看完關于惰性聯苯柱在生物相關代謝物分析中的應用后，您實際工作中的問題是否得到了解答呢？如您有任何疑問，歡迎撥_打 4000 815 005 熱線聯系 Restek 技術團隊。同時您還可申請產品試用，優異性能，即刻體驗！
研究合作單位
Restek Corporation
瑞思泰康科技有限公司
School of Pharmaceutical Sciences, University of Geneva
日內瓦大學藥學院
Institute of Pharmaceutical Sciences of Western Switzerland University of Geneva
日內瓦大學瑞士西部制藥科學研究所
Swiss Centre for Applied Human Toxicology (SCAHT)
瑞士人類應用毒理學中心
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