無細胞蛋白表達（Cell-free protein synthesis）是指將細胞內(nèi)合成蛋白所需要的RNA聚合酶、核糖體及轉(zhuǎn)錄翻譯輔助因子等分子機器提取出來，并輔以核苷酸、氨基酸、能量物質(zhì)及基因模板，在沒有活細胞參與的體外直接合成蛋白質(zhì)的生物合成反應(yīng)。無細胞蛋白表達的技術(shù)原理是中心法則，是轉(zhuǎn)錄和翻譯的體外進行。即在無細胞結(jié)構(gòu)的反應(yīng)體系中，目的蛋白的DNA 模板在RNA聚合酶的作用下轉(zhuǎn)錄出mRNA ，隨后在氨酰-tRNA合成酶、核糖體以及tRNA的作用下，以mRNA為模板翻譯出目的蛋白。

一是反應(yīng)周期短，無細胞蛋白表達省去了傳統(tǒng)細胞表達轉(zhuǎn)染、培養(yǎng)等步驟，可以在幾小時到一天內(nèi)表達蛋白。以蘇州珀羅汀（PLD technology）的無細胞試劑盒為例，最快可以1小時產(chǎn)出蛋白，適合進行蛋白快速交付。

二是可以與自動化設(shè)備結(jié)合，在多孔板（如96孔板），進行自動化高通量蛋白表達，短時間內(nèi)高通量蛋白篩選的需求，適合酶定向進化篩選、AI蛋白制造等領(lǐng)域。

三是可表達蛋白種類多。有些蛋白在傳統(tǒng)的細胞表達系統(tǒng)產(chǎn)量低甚至不能表達，而無細胞系統(tǒng)可以擺脫細胞自身生理功能限制，廣泛適用于細胞因子、抗體、膜蛋白、毒性蛋白、包涵體蛋白表達等場景。

四是自由度與可控程度高，可以引入非天然氨基酸，實現(xiàn)特定位置修飾，適合ADC藥物開發(fā)領(lǐng)域。此外，無細胞蛋白表達相較于傳統(tǒng)細胞表達流程更短、操作更簡便。

無細胞蛋白表達能解決傳統(tǒng)蛋白表達流程長、耗時久、膜蛋白與毒蛋白等難表達的痛點與難點。無細胞體系可以表達膜蛋白，目前國內(nèi)的珀羅汀生物有適合膜蛋白的無細胞蛋白表達試劑盒，只要按照說明書將膜蛋白的DNA模板，合適的表面活性劑或納米盤等，加到表達試劑中，幾小時到一天就能得到膜蛋白。

珀羅汀無細胞表達系統(tǒng)可以通過控制反應(yīng)溫度、添加分子伴侶、輔助因子等，幫助形成正確的蛋白折疊，合成的蛋白具有與細胞表達系統(tǒng)相當(dāng)甚至更好的活性。與常規(guī)的細胞表達一樣，無細胞系統(tǒng)表達產(chǎn)物除目標(biāo)蛋白之外還有其他蛋白殘留。對于抗體親和性和酶活性的檢測，無細胞表達產(chǎn)物可以無需純化直接測試；對于有蛋白純度要求或需要進行細胞實驗的項目，按照相應(yīng)蛋白常規(guī)表達后的純化流程操作即可。

無細胞技術(shù)可以表達二硫鍵蛋白，但具體視廠商的產(chǎn)品而異。珀羅汀生物推出的無細胞蛋白表達產(chǎn)品均支持表達二硫鍵蛋白。原核生物來源的無細胞體系無糖基化修飾，真核生物來源的無細胞體系具有有限的糖基化修飾。

 Q6：無細胞體系的效能如何？可以放大到什么規(guī)模？

無細胞體系的效能一般與目標(biāo)蛋白有關(guān)，表達量從μg/mL到數(shù)百μg/mL不等。以珀羅汀生物無細胞蛋白表達試劑盒為例，蛋白表達量最高可以達到3 mg/mL。無細胞體系可以放大，已有進行百升級規(guī)模化生產(chǎn)的報道。

線性模板、質(zhì)粒模板都可以。但是線性模板要在目的基因兩端各引入一段特定序列，以在目的基因兩側(cè)引入轉(zhuǎn)錄和翻譯所需的因子。PLD無細胞蛋白表達試劑盒會提供質(zhì)粒載體，將目的基因重組到質(zhì)粒載體上，表達效果往往優(yōu)于線性模板。無細胞試劑盒一般對DNA模板在反應(yīng)體系中的濃度有要求，要根據(jù)具體要求與反應(yīng)規(guī)模確定模板的用量。