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細胞復蘇全過程：
細胞復蘇是將休眠的細胞重新活化，使之重新生長，進入細胞周期，進而分裂產生子細胞的過程。細胞復蘇后，可進入細胞周期，重新獲得細胞類型特異的生物學功能。
一、 實驗前準備
實驗開始前，將無菌培養瓶，15ml 離心管、移液管、移液槍、槍頭等放入無菌超凈工作臺，以紫外線照射 30min。然后，采用通風機通風 3min。以 75%酒精擦拭操作臺和雙手。
準備好冰盒。
將離心機調節至 800rpm，5min。水浴箱調節至 37 度恒溫。取細胞培養基，放于水浴箱中預熱。
消毒雙手和超凈臺。取約 10ml 細胞培養基放于 15ml 離心管中。
實驗前備冰盒，快速由液氮中取出凍存的細胞，置于冰盒內。然后迅速將凍存管投入到已經預熱到 37 度的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動，使管中的液體迅速融化，注意管口處高于水面，以免進入導致污染。整個解凍過程最好在 1 分鐘以內，以防融化過程中產生大量冰晶損傷細胞，約 1min 后凍存管內液體溶解，取出用酒精噴拭凍存管的外壁，立即拿入超凈臺內。
二、制備細胞懸液
以無菌槍頭吸取細胞凍存液，置于已放入細胞培養基的離心管中，上下吹打 5 次，使凍存液與培養基充分混勻，盡量減少凍存液中 DMSO 的濃度，減輕細胞損傷。以封口膜封好管口。
配平離心：采用天平配平兩端，800rpm，室溫離心 5min。
三、細胞計數
采用細胞計數儀 快速細胞計數及活率分析儀進行細胞計數。加入 10ml CASY-ton 至以標記 viable 的管子中，加入 100ul 細胞懸液，顛倒混勻三次，可進行細胞計數?？梢娒亢辽龖乙褐杏谢罴毎?2 乘 10 的 5 次方.
四、細胞培養
離心后，吸棄上清液，不要吸到底部的細胞沉淀。根據計數結果，向離心管內的細胞沉淀加入 10ml海星細胞培養基，反復吹打制成細胞懸液，吹打過程中盡量不要產生氣泡。符合細胞計數要求的細胞懸液分裝入培養瓶內，左右輕輕搖動培養瓶，把細胞搖均勻，將NEST培養瓶放入 37℃，5％CO2 的培養箱中培養， 2-4 小時或者 24-48 小時后換液繼續培養，換液的時間由細胞情況而定，一般以大部分細胞狀態良好時換液為宜，比如超過半數的細胞貼壁，
即可換液。
五、注意事項
1、取凍存管要做好保護措施
取細胞的過程中未帶好防凍手套，護目鏡。此項尤為重要，細胞凍存管可能漏入液氮，解凍時凍存管中的氣溫急劇上升，可導致爆炸,當然，選擇好的凍存管此狀況一般不會發生。
2、解凍速度要快
在常溫下，凍存液中的 DMSO 對細胞的毒副作較大，因此，必須在一到兩分鐘內使凍存液融化。如果復蘇溫度太慢，會造成細胞的損傷。
3、細胞貼壁少
一般凍存細胞解凍時 1ml 細胞液要加 10ml－15ml 培養液，培養基加入過多，造成細胞濃度過低，不利于細胞的貼壁，所以進行細胞的計數尤為重要。
4、一次復蘇細胞不宜過多
細胞在解凍時，水浴鍋內凍存管太多，導致傳熱不佳，使融化時間延長。正
規來說，需要迅速將凍存管投入到已經預熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動，使管中的液體迅速融化。并且一次復蘇細胞過多，容易忘記更換吸頭和吸管，導致細胞交叉污染。
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來源：蘇州阿爾法生物
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