在細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，Immortalized Mouse WildType Aortic Endothelial Cells（iMAEC-WT，永生化小鼠野生型主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞）具有重要研究價(jià)值。掌握其規(guī)范化的操作使用流程，不僅有助于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性與可靠性，還能最大限度地發(fā)揮細(xì)胞模型的優(yōu)勢。

細(xì)胞復(fù)蘇操作要點(diǎn)

從液氮程序降溫凍存盒中取出凍存管時(shí)，必須佩戴防護(hù)手套與護(hù)目鏡，因?yàn)橐旱蜏乜赡軐?dǎo)致凍傷與冷沖擊。將凍存管迅速置于 37℃水浴中搖晃，使細(xì)胞在 1 分鐘內(nèi)快速解凍，這一過程能有效防止細(xì)胞內(nèi)冰晶形成對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞。

解凍后的細(xì)胞需立即用無菌離心管收集，加入適量含有 10%胎牛血清與青霉素 / 鏈霉素雙抗的培養(yǎng)基，以 800rpm 離心 5 分鐘，去除殘留的 DMSO（二甲基亞砜），避免其對(duì)細(xì)胞造成毒性。

細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按照合適密度接種至預(yù)先包被好細(xì)胞外基質(zhì)的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，初始培養(yǎng)階段應(yīng)保證培養(yǎng)環(huán)境穩(wěn)定，培養(yǎng)箱溫度嚴(yán)格設(shè)定為 37℃，CO?濃度維持在 5%，濕度保持在 95%以上，細(xì)胞貼壁后 4 - 6 小時(shí)內(nèi)觀察細(xì)胞狀態(tài)，正常情況下細(xì)胞會(huì)逐漸恢復(fù)新陳代謝與生長活力。

傳代培養(yǎng)關(guān)鍵參數(shù)

當(dāng)細(xì)胞生長至培養(yǎng)容器的 80% - 90%融合度時(shí)，便是進(jìn)行傳代的最佳時(shí)機(jī)。傳代比例依據(jù)細(xì)胞生長速度與實(shí)驗(yàn)需求而定，通常建議在 1:3 至 1:6 范圍內(nèi)。

使用 0.25%胰蛋白酶 - 0.02% EDTA 消化液時(shí)，需精準(zhǔn)把控消化時(shí)間，一般 37℃下 1 - 2 分鐘即可，過度消化會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜受損與細(xì)胞骨架破壞，出現(xiàn)細(xì)胞碎屑增多、細(xì)胞活力下降等問題。

新培養(yǎng)基添加后，輕柔吹打使細(xì)胞均勻分布，避免產(chǎn)生細(xì)胞團(tuán)塊，隨后置于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，整個(gè)傳代操作需在無菌環(huán)境下進(jìn)行，嚴(yán)格遵守層流臺(tái)操作規(guī)范，防止細(xì)菌、真菌污染，一旦發(fā)現(xiàn)污染跡象，應(yīng)立即終止實(shí)驗(yàn)，對(duì)培養(yǎng)器具進(jìn)行消毒處理。

凍存策略與注意事項(xiàng)

凍存操作是細(xì)胞保存的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，優(yōu)質(zhì)的凍存程序能確保細(xì)胞在長期保存后仍具備良好的復(fù)蘇活性。凍存前，細(xì)胞需處于良好的生長狀態(tài)，傳代 1 - 2 次后，用胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞，用冷的凍存液重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至合適濃度，一般為 1×10? - 5×10? cells/ml。

將細(xì)胞懸液分裝入提前預(yù)冷的凍存管中，做好標(biāo)記，記錄細(xì)胞名稱、凍存日期、代數(shù)等信息。放入程序降溫盒后，按照每分鐘下降 1℃的速度緩慢降溫，直至 - 80℃，24 小時(shí)后轉(zhuǎn)移至液氮罐長期保存，這一過程能有效降低細(xì)胞內(nèi)水分結(jié)晶對(duì)細(xì)胞的損傷，提高細(xì)胞復(fù)蘇后的存活率與活性。

定期對(duì)液氮罐進(jìn)行檢查維護(hù)，確保液氮充足，防止因液氮泄漏導(dǎo)致細(xì)胞失活，同時(shí)建立完整的細(xì)胞凍存檔案，方便后續(xù)細(xì)胞復(fù)蘇與實(shí)驗(yàn)安排。