一、細胞簡介

永生化小鼠系膜細胞 - SV40 是一種經過 SV40 病毒大 T 抗原轉化的細胞系。這種細胞系具有無限增殖的能力，同時保留了系膜細胞的一些特性。SV40 病毒通過整合到宿主細胞基因組中，使細胞繞過正常的衰老和凋亡機制，實現永生化。這對于細胞生物學研究、疾病模型建立以及藥物篩選等領域具有重要價值。

二、培養前的準備

（一）培養基的配制

選擇合適的培養基是細胞培養成功的關鍵。對于永生化小鼠系膜細胞 - SV40，通常使用 Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）培養基。在配制培養基時，需要添加 10% 胎牛血清（FBS），以提供細胞生長所需的營養物質和生長因子。此外，還可以添加 1% 的青霉素 - 鏈霉素溶液，以防止細菌和真菌的污染。所有試劑應確保新鮮且無菌，避免因試劑質量問題影響細胞的生長。

（二）培養容器的選擇與處理

細胞培養容器應選擇透氣性好、無毒且表面經過處理的培養皿或培養瓶。在使用前，需用 75% 的酒精對培養容器進行消毒，并在超凈工作臺內進行操作，以降低污染的風險。對于一些特殊實驗，可能需要使用特定的培養表面，如包被有膠原蛋白或纖維連接蛋白的培養皿，以促進細胞的貼壁和生長。

（三）細胞的復蘇

從液氮中復蘇細胞時，應迅速將細胞從液氮罐中取出，放入 37℃水浴中快速解凍。解凍后的細胞應立即用新鮮的培養基進行稀釋，并輕輕吹打混勻。然后將細胞懸液轉移到培養容器中，置于 37℃、5% CO?的培養箱中靜置培養。在復蘇后的前 24 小時內，避免對細胞進行頻繁的操作，以讓細胞有足夠的時間恢復活力。

三、細胞培養的操作流程

（一）細胞的接種

根據實驗需求，確定合適的細胞接種密度。一般來說，永生化小鼠系膜細胞 - SV40 的接種密度可在 5×103 - 1×10? cells/cm2 之間。將細胞懸液均勻地接種到培養容器中，確保細胞分布均勻，避免局部細胞密度過高或過低。接種后，輕輕晃動培養容器，使細胞與培養表面充分接觸，有利于細胞的貼壁。

（二）原代培養

在原代培養階段，細胞需要適應新的培養環境。將接種好的培養容器放入 37℃、5% CO?的培養箱中培養。培養初期，細胞可能會經歷一個滯后期，生長速度較慢。此時應保持培養環境的穩定，避免頻繁擾動細胞。定期觀察細胞的生長狀態，如細胞的形態、顏色以及是否有污染跡象等。一般在培養 24 - 48 小時后，細胞會逐漸進入生長期，開始增殖。

（三）細胞的傳代

當細胞生長至培養容器表面的 80% - 90% 匯合時，即可進行傳代操作。首先，用無菌的 PBS 洗滌細胞 2 - 3 次，以去除培養基中的血清成分。然后加入適量的 0.25% 胰蛋白酶 - 0.02% EDTA 溶液，在 37℃下孵育 1 - 2 分鐘，使細胞從培養表面脫落。在顯微鏡下觀察細胞的脫落情況，避免過度消化導致細胞損傷。隨后，加入含血清的培養基終止消化，用吸管輕輕吹打細胞，制成均勻的細胞懸液。按照 1:2 - 1:3 的比例將細胞懸液分裝到新的培養容器中，加入新鮮的培養基，繼續培養。

（四）細胞的凍存

對于長期保存的需要，可將細胞進行凍存。在凍存前，確保細胞處于良好的生長狀態，無污染。用胰蛋白酶消化細胞，制成細胞懸液，然后按照 5×10? - 1×10? cells/ml 的濃度將細胞懸液與凍存液（一般含 10% DMSO 的 FBS）混合。將混合好的細胞懸液分裝到凍存管中，每個凍存管裝 1 - 1.5 ml。然后將凍存管放入程序降溫盒中，放入 - 80℃冰箱過夜。第二天，將凍存管轉移到液氮罐中長期保存。凍存過程中，應盡量減少溫度變化對細胞的沖擊，以提高細胞的復蘇率。

四、常見問題及解決方案

（一）細胞污染

細胞污染是細胞培養過程中常見的問題之一。污染物可能來源于培養基、試劑、培養容器以及操作過程中的空氣等。一旦發現細胞受到細菌、真菌或支原體等污染，應立即停止培養，并對污染的細胞進行處理。對于輕度污染的細胞，可以嘗試使用抗生素或抗真菌藥物進行治療，但這種方法可能會對細胞產生一定的毒性作用，影響細胞的正常生長。因此，在細胞培養過程中，應嚴格遵守無菌操作原則，定期對培養環境和試劑進行消毒處理，以預防細胞污染的發生。

（二）細胞生長緩慢

細胞生長緩慢可能由多種因素引起，如培養基的營養成分不足、細胞密度過高或過低、培養環境不穩定等。首先，應檢查培養基的質量，確保其成分新鮮、無污染且符合細胞生長的要求。如果培養基存在問題，應及時更換。其次，調整細胞的接種密度，使其處于適宜的范圍內。此外，保持培養環境的穩定，如溫度、CO?濃度等，對細胞的生長也至關重要。定期觀察細胞的生長狀態，及時發現問題并采取相應的措施進行調整。

（三）細胞形態異常

細胞形態異常可能提示細胞的生理狀態發生了變化，如細胞受到應激、損傷或發生了惡性轉化等。導致細胞形態異常的原因有很多，包括培養條件的改變、細胞傳代次數過多、病毒感染等。在細胞培養過程中，應密切觀察細胞的形態變化。如果發現細胞形態異常，應首先檢查培養條件是否符合要求，如溫度、CO?濃度、培養基成分等。同時，回顧細胞的傳代歷史，確保傳代次數在合理范圍內。對于受到病毒感染的細胞，應及時進行隔離和處理，防止病毒擴散到其他細胞培養體系中。