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基于Bradford考馬斯亮藍(lán)染料的蛋白定量 

Bradford 法又稱(chēng)考馬斯亮藍(lán)法，用于快速，簡(jiǎn)便的蛋白質(zhì)定量。這種定量方法在室溫進(jìn)行，無(wú)需特殊儀器。將配制好的考馬斯亮藍(lán) G-250 檢測(cè)試劑加入標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品中，經(jīng)過(guò)短暫的室溫孵育即可在 595 nm 處測(cè)定吸光值。Bradford 法蛋白定量與蛋白質(zhì)樣品中常見(jiàn)的鹽離子、溶劑、緩沖液、硫醇、還原性物質(zhì)和金屬螯合劑相兼容。 

Bradford Plus蛋白定量試劑盒全新推出內(nèi)含免稀釋蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的版本，不用稀釋標(biāo)準(zhǔn)品、縮短標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作時(shí)間、減少移液失誤。 免稀釋蛋白標(biāo)準(zhǔn)品是一組與排槍兼容的預(yù)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，使您可以輕松地將稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品一步轉(zhuǎn)移到微孔板中。 

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輕松、快速、準(zhǔn)確 

熱門(mén)BCA 蛋白定量試劑盒現(xiàn)自帶免稀釋 BSA 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品——7個(gè)濃度的預(yù)稀釋BSA標(biāo)準(zhǔn)品，專(zhuān)為排槍設(shè)計(jì)。 

Pierce 免稀釋蛋白定量產(chǎn)品可大幅減少傳統(tǒng)定量實(shí)驗(yàn)中繁瑣的稀釋操作，并使用來(lái)自美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院 (NIST) 的純化 BSA進(jìn)行校準(zhǔn)，以確保標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的準(zhǔn)確性。 

Bradford 法定量原理 

Marion Bradford 博士于 1976 年提出了使用考馬斯 G-250 染料作為比色試劑對(duì)總蛋白進(jìn)行檢測(cè)和定量的方法。Pierce Coomassie Bradford 蛋白定量試劑盒是基于 Bradford 博士首先報(bào)道的試劑而優(yōu)化。 

Bradford 試劑, 基于考馬斯的蛋白定量 

在酸性環(huán)境中，蛋白質(zhì)結(jié)合考馬斯染料。這導(dǎo)致染料的最大吸收發(fā)生位移，從紅棕色形式（最大吸收峰 465nm）轉(zhuǎn)化為藍(lán)色形式（最大吸收峰 610nm）。染料的兩種形式在 595nm 處差異最大，因此 595nm 是測(cè)定考馬斯染料-蛋白復(fù)合物的藍(lán)色的最佳波長(zhǎng)。如有必要，可以 575nm 到 615nm 之間的任意波長(zhǎng)測(cè)量該染料的藍(lán)色。在兩個(gè)波長(zhǎng)（575nm 和 615nm）下，與在 595 nm 處獲得的顏色（吸光度）相比，測(cè)得的顏色量（吸光度）降低了大約 10％。基于考馬斯染料的蛋白質(zhì)檢測(cè)法中，顏色的形成是與某些堿性氨基酸（主要是精氨酸、賴(lài)氨酸和組氨酸）有關(guān)。范德華力和疏水相互作用也影響染料-蛋白質(zhì)的結(jié)合。結(jié)合到每個(gè)蛋白質(zhì)分子上的考馬斯染料分子數(shù)大致與蛋白所帶正電荷的數(shù)量成正比。游離氨基酸、肽和低分子量蛋白質(zhì)不會(huì)與考馬斯染料試劑產(chǎn)生顏色。一般情況下，肽或蛋白質(zhì)的質(zhì)量必須大于 3,000 道爾頓才能被該試劑檢出。在某些應(yīng)用中，這是一個(gè)優(yōu)點(diǎn)。 

圖 1.基于考馬斯染料的 Bradford 蛋白檢測(cè)的反應(yīng)示意圖：Pierce Coomassie（Bradford 法）蛋白檢測(cè), Pierce Coomassie Plus（Bradford 法）蛋白檢測(cè), 和 Pierce 去垢劑兼容的 Bradford 檢測(cè)。 

考馬斯蛋白檢測(cè)法的主要缺點(diǎn)是它們與常規(guī)用于溶解膜蛋白的表面活性劑濃度不兼容。通常，當(dāng)樣品中存在去垢劑時(shí)，即使?jié)舛群艿停矔?huì)導(dǎo)致該試劑形成沉淀。可以使用 去垢劑兼容型Bradford定量試劑來(lái)克服此限制。另外，Coomassie 染料試劑是強(qiáng)酸性的，所以酸溶解度較差的蛋白不能用該試劑來(lái)測(cè)定。最后，Coomassie 試劑導(dǎo)致的蛋白間差異性大約是基于銅螯合的檢測(cè)試劑的兩倍。 

產(chǎn)品推薦 

Bradford Plus蛋白定量試劑盒（內(nèi)含免稀釋標(biāo)準(zhǔn)品） 

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圖 2. 使用Bradford Plus蛋白定量試劑盒（內(nèi)含免稀釋標(biāo)準(zhǔn)品）進(jìn)行蛋白定量實(shí)驗(yàn)。 

去垢劑兼容型 Bradford 檢測(cè) 

Pierce 去垢劑兼容型 Bradford 定量試劑盒是 Bradford考馬斯染料結(jié)合比色法進(jìn)行快速，即用的改進(jìn)，用于總蛋白質(zhì)定量。該配方與濃度高達(dá) 1％ 的常用去垢劑兼容。將 Pierce 去垢劑兼容型 Bradford 檢測(cè)與 Bio-Rad Dc 蛋白檢測(cè)進(jìn)行比較，使用 Pierce 去垢劑兼容型 Bradford 定量（使用常規(guī)去垢劑）時(shí)，靈敏度更高。Pierce 去垢劑兼容型 Bradford 檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)范圍是 Bio-Rad DC 檢測(cè)范圍的 4 倍。 

圖 2.Bradford 蛋白定量 vs. Bio-Rad DC 蛋白定量每個(gè)定量檢測(cè)均在微孔板上使用加有去垢劑或水（對(duì)照）的 BSA 標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行，并遵循制造商的說(shuō)明。 

表 1.比較 Pierce 去垢劑兼容型 Bradford 定量試劑盒與 Bio-Rad DC 蛋白定量試劑盒。 

660 nm法 

Pierce 660 nm 定量原理 

Pierce 660 nm 定量試劑 

Pierce 660nm 蛋白檢測(cè)基于酸性條件下的染料-金屬?gòu)?fù)合物與蛋白質(zhì)的結(jié)合，這種結(jié)合會(huì)導(dǎo)致染料在 660 nm 處的最大吸收吸收發(fā)生位移。該染料-金屬?gòu)?fù)合物為紅褐色，在與蛋白結(jié)合后變?yōu)榫G色。這種顏色的變化是由于染料在低 pH 值時(shí)的脫氫導(dǎo)致的，而蛋白內(nèi)的帶正電荷的氨基酸殘基和帶負(fù)電的染料-金屬?gòu)?fù)合物的相互作用促進(jìn)了這一過(guò)程。因此，該染料主要與蛋白質(zhì)中的堿性殘基（例如組氨酸，精氨酸和賴(lài)氨酸）相互作用，而與酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸相互作用程度相對(duì)較小。 

即使在存在與 Bradford 和 BCA 蛋白檢測(cè)不兼容的去垢劑和還原劑的情況下，檢測(cè)中產(chǎn)生的顏色也很穩(wěn)定并在很大范圍內(nèi)與蛋白質(zhì)濃度成正比。可以將可選的 IDCR 添加到檢測(cè)試劑中，以增加與大量離子去垢劑的相容性，從而可以測(cè)量含有 Laemmli SDS 樣品緩沖液和溴酚藍(lán)的樣品。IDCR 通過(guò)混合溶解，對(duì)檢測(cè)沒(méi)有任何影響。 

圖 3.660 nm 檢測(cè)試劑-金屬?gòu)?fù)合物的最大吸光度與所結(jié)合的 BSA 成正比。當(dāng)試劑-金屬?gòu)?fù)合物存在時(shí)，蛋白質(zhì)在 660 nm 波長(zhǎng)處產(chǎn)生明顯的吸光度偏移。 

使用 Pierce 660nm 蛋白檢測(cè)試劑盒進(jìn)行蛋白定量 

Pierce 660 nm 檢測(cè)試劑盒比基于考馬斯的 Bradford 檢測(cè)具有更出色的線(xiàn)性，并且與更高濃度的大多數(shù)去垢劑、還原劑和其他常用試劑兼容。附件的離子去垢劑兼容性試劑（IDCR）提供了更廣泛的去垢劑兼容性，這使其成為一種適用于含有 Laemmli SDS 樣品緩沖液和溴酚藍(lán)的樣品的蛋白檢測(cè)方法。盡管 Pierce 660 nm 蛋白檢測(cè)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)間變異性比其他檢測(cè)法（如 BCA 蛋白檢測(cè)法）高（37％），但更簡(jiǎn)單的單試劑形式和更廣泛的物質(zhì)相容性使 Pierce 660 nm 蛋白檢測(cè)法更適合許多常規(guī)應(yīng)用。Pierce 660nm 蛋白檢測(cè)可以以試管或微孔板的形式進(jìn)行。 

圖 4.性能比較和典型顏色響應(yīng) 

A：Bio-Rad Bradford 蛋白檢測(cè)與 Thermo Scientific Pierce 660nm 蛋白檢測(cè)的性能比較。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)試管程序，使用 100 µL BSA 進(jìn)行測(cè)定與 Bradford 檢測(cè)（125 至 1000 µg）相比，Pierce 660nm 蛋白檢測(cè)的線(xiàn)性范圍更寬（25 至 2000 µg）。在每種檢測(cè)的適當(dāng)波長(zhǎng)（分別為 660nm 和 595nm）下測(cè)量吸光度。使用試管程序的典型顏色響應(yīng)曲線(xiàn) 

B：使用試管程序的典型顏色響應(yīng)曲線(xiàn)。牛血清白蛋白（BSA）的線(xiàn)性檢測(cè)范圍為 25 至 2000 µg/mL，牛丙種球蛋白（BGG）的線(xiàn)性檢測(cè)范圍為 50 至 2000 µg/mL。由于所有蛋白質(zhì)檢測(cè)固有的蛋白質(zhì)間變異性（對(duì)于 660nm 蛋白質(zhì)檢測(cè)為 37％），這表明應(yīng)該為要測(cè)量的未知樣品類(lèi)型使用適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)品。 

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