正常人胚肺成纖維細胞的培養

實驗材料：

1. 肺組織：取自妊娠14—18周的胎兒；

2. 不含Ca2+和Mg2+的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L鏈霉素，pH7.2；

3. 消化液：0.25%胰蛋白酶（pH7.6—7.8），0.02%EDTA溶液；

4. 培養液：DMEM或RPMI1640，加10%—20%胎牛血清、青霉素100IU/ml、鏈霉素100μg/ml；

5. 保存液：10%二甲亞砜或10%甘油；

6. 眼科剪、眼科鑷等無菌消毒手術器械；

7. 離心管（15ml、50ml）

實驗方法：

1. 取水囊引產的妊娠3—6個月的胎兒。用75%乙醇消毒胸壁。剖胸取出兩肺。剪去肺內較大的支氣管后，將肺邊緣組織置于平皿中，用PBS液清洗3次，除去血液。選擇蒼白色的肺組織，剪成1mm3左右的碎塊。再用PBS液洗2—3次，直至液體澄清為止；

2. 將肺組織塊移入三角瓶中，加入5—6倍量的0.25%胰蛋白酶，密封瓶口。置4℃冰箱內消化20h；

3. 吸棄上層液體。往三角瓶中加入少量培養液，用吸管反復吹打分散細胞。稍靜置，待殘存的組織塊下沉后，吸出細胞懸液；

4. 計數細胞，并用培養液調節細胞密度；

5. 將細胞以3×106個/ml的密度接種于培養瓶中，于37℃、5%CO2培養箱中培養。24h后換液，除去未貼壁的細胞及細胞碎片。以后每隔2—3d換液一次；

6. 待細胞匯合成片后，用0.25%胰蛋白酶與0.02%EDTA（1：1，V/V）混合消化液消化細胞，進行繼代培養；

7. 如果要凍存細胞，以便長期使用，可以將成片細胞經消化分散后，懸浮于保存液中，調節細胞密度至1.5×106—2.0×106個/ml。每管1—2ml分裝入凍存管，置于液氮罐中保存；