【摘要 】 目的 采用 HSF1基因敲除小鼠模型探討熱休克因子 1及熱休克蛋白 （ heat shock p r otein,
HSP）在慢性心理應激中對工作記憶的保護作用。方法 將熱休克因子 1 （ heat shock fact or 1）基因野生型
小鼠 （HSF1 + / + ）和熱休克因子 1基因敲除小鼠 （HSF12/2 ）暴露于 2個月的慢性心理應激 ,部分小鼠在暴
露于心理應激前給予熱休克預處理 , 2個月后采用 T迷宮檢測各組小鼠工作記憶 ,western bl ots檢測和比較
HSP72, HSP25表達 ,采用單因素方差分析和多因素析因設計方差分析對各組小鼠 T迷宮轉換正確數和
HSP72, HSP25表達進行比較。結果 HSF1基因野生型小鼠中 ,慢性心理應激對 T迷宮轉換正確數 （8 . 90
± 0 . 46）次與對照組 （9 . 58 ± 0 . 48）次沒有明顯影響 （ F （1, 65） = 0 . 23, P > 0 . 05） , HSF1基因敲除小鼠中 ,慢
性心理應激引起 T迷宮轉換正確數 （4 . 00 ± 0 . 26）次明顯低于對照組 （7 . 33 ± 0 . 43）次 , F （1, 65） = 32 . 39, P <
0 . 05）。同時野生型小鼠心理應激后海馬組織中 HSP72表達 （1 . 35 ± 0 . 11） , HSP25表達 （1 . 05 ± 0 . 03）明顯
高于 HSF1基因敲除小鼠 （ 0 . 23 ±0 . 03 ） , （ 0 . 26 ±0 . 02 ） ,均 P < 0 . 05 ）。熱應激也誘導 HSP72 （ 1 . 71
± 0 . 05） , HSP25 （1 . 33 ± 0 . 05）表達增加 ,明顯高于 HSF1基因敲除小鼠 [ （0 . 26 ± 0 . 03） , （0 . 23 ± 0 . 08） ,均
P < 0 . 05 ] ,但未發現熱應激預處理對 T迷宮轉換正確數有影響 （ F （1, 65） = 0 . 32, P > 0 . 05）。結論 HSF1以
及慢性心理應激誘導的 HSP72, HSP25表達 ,在慢性心理應激中對工作記憶具有保護作用。
【關鍵詞 】 工作記憶; 熱休克蛋白; 熱休克因子 1; 慢性心理應激; T迷宮

長時記憶與工作記憶都與海馬有關。慢性社會心
應激可以損傷海馬 ,引起海馬依賴的長時記憶功能
害[ 1 ]
,但不影響工作記憶[ 2 ]
。急性應激及輕度應激
以引起工作記憶損害[ 3, 4 ]
,其機制與交感神經的激
有關[ 5 ]
。而慢性社會心理應激不引起工作記憶損
害 ,其原因目前尚不清楚。熱休克反應和慢性心理應
激都可以激活 HSF1 （ heat shock fact or1, HSF1） ,誘導
熱休克蛋白 （ heat shock p rotein, HSP）表達增加 ,包括
HSP72、 HSP25,他們在應激中具有重要的抗應激、 保護
細胞、 維持細胞正常結構和功能的作用。而 HSP表達
對心理應激鼠工作記憶是否具有保護意義目前尚不清楚。因此 ,本研究采用 HSF1野生型小鼠和 HSF1基因
敲除小鼠 ,給予慢性心理應激及熱休克預處理 , T迷宮
評定各組小鼠工作記憶 , western bl ots檢測 HSP72、
HSP25表達 ,以探討熱休克預處理及慢性心理應激誘導的 HSP表達在心理應激過程中對工作記憶是否具
有保護作用。
材料與方法
一、 動物與分組
本實驗動物來自美國德克薩斯大學西南醫學實驗
中心培育的 HSF1基因敲除雜合子進行繁殖得來的野
生型小鼠 （基因型為: HSF1 + / + ,簡稱 HSF1 + / +小
鼠 ）和 HSF1基因敲除的純合子 （基因型為: HSF12/2 ,
簡稱 HSF12/2 小鼠 ） ,在中南大學湘雅二院動物實驗中
心飼養。全價營養飼料 ,光照 8AM～8PM,室溫 （24 ±
0 . 5） ℃。
6～7月齡小鼠經行為觀察剔除行為表現的
小鼠后 ,共選取 65只進入實驗 ,其中 HSF1 + / +小鼠
共 37只 ,隨機分為 4組:對照組 （NS組 ） 12只 ,不給予
實驗應激;心理應激組 （ PS組 ） 10只 ,給予心理應激;
熱休克預處理組 （HS組 ） 6只 ,給予熱休克預處理;熱
休克預處理加心理應激組 （HS + PS組 ） 9只 ,給予熱休
克預處理和心理應激。HSF12/2 小鼠共 28只 ,同樣分
為 NS組 12只 , HS組 6只 , PS組 5只, HS + PS組 5
只 ,分別接受與相對應的 HSF1 + / +小鼠各組同樣處理。實驗過程中死亡的小鼠未記在內。
二、 動物模型制備
1 . 熱休克預處理[ 6 ]
:采用自制的加熱裝置加熱 ,
使小鼠肛溫達 （40 ± 1） ℃,維持約 15min。熱休克預處
理每周 2次 ,于周一和周四給予。
2 . 心理應激:心理應激包括限制應激,高臺應激
和旁觀電擊應激。①限制應激[ 7 ]
:將小鼠置于自制的
不透明塑料小瓶中 （直徑 4 cm,長 8 cm） ,使其無法在
里面自由活動。限制應激每周 2次 ,每次 1 h。②高臺
應激[ 8 ]
:把實驗小鼠放置在一個 10 cm × 10 cm,高1 . 6m
的平臺上 ,平臺放置在光線良好的房間的*。高臺
應激每周 2次 ,每次 1 h。③旁觀電擊應激:旁觀電擊
應激參照鄒濤等[ 9 ]
的方案進行 ,旁觀電擊每周 2次 ,每
次 1 h,電擊每次持續 5 s,頻率為 1次 /min。
三、 工作記憶評定
根據文獻自制的 T型迷宮[ 10 ]
由兩條等長通道
（75 cm × 12 cm × 20 cm）組成 ,其中豎直部分的末端用
不透明活動門隔出 24cm的通道作為實驗動物的起始
位置。而兩臂的兩端分別作為兩個目標位置 ,在兩臂
的入口分別有兩扇不透明活動門 ,可以對活動門進行開關操作。在迷宮周圍有明顯的視覺參考物。實驗開
始時將實驗小鼠放置在起始位置處 ,打開起始位置的
活動門 ,關上其中一臂入口處的活動門。由于小鼠的
探索天性 ,小鼠會進入迷宮另一臂 ,實驗小鼠探索完回
到起始位置后 ,關上起始位置的活動門 ,讓實驗小鼠在
起始位置內待 5 s,而后把三扇活動門全部打開 ,這時
實驗小鼠能選擇兩臂中的任意一段進行探索 ,當實驗
小鼠進入其中一臂后 ,關上另一臂的活動門。當實驗動物從目標區域回到起始區域后 ,關上起始區域的活
動門 ,讓動物在起始區域中待 5 s。以后重復第二個步
驟 14次。記錄動物每次探索和前一次不同臂的比例 ,
即為 T迷宮正確轉換數。
四、 組織收集
各組動物經在 2個月相應處理 ,行為觀察 12 h后
斷頭處死 ,迅速于冰上剝出海馬 ,液氮中凍存備用。
五、 提取蛋白和 western2 bl ots
取出凍存海馬 ,液氮中研磨成粉,裂解液裂解提取
海馬總蛋白 ,紫外分光光度法定量 ,上樣 ,經 10% SDS 2
聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質 ,轉膜 ,封閉 ,一抗
（ anti2 HSP72, anti2 HSP25, stressgen ） 4℃靜置孵育過
夜 ,二抗室溫搖床搖 1 h, DAB顯色 ,全自動圖像分析
系統進行光密度指數分析 , HSP含量以同一張膜上的
HSP含量與 GAPDH含量的比值來表示。
六、 數據分析
數據采用 SPSS12 . 0統計軟件 ,數據采用均數 ±
標誤表示 ,多組比較采用單因素方差分析和多因素析
因設計方差分析 ,兩兩比較采用 t檢驗。結 果
一、 工作記憶功能評定
HSF1基因、 熱休克預處理、 心理應激對小鼠在 T
迷宮轉換正確數的影響見表 1。單因素方差分析結果
顯示:不同基因型、 不同處理組之間 T迷宮轉換正確
數之間有顯著性差異 （ F = 17 . 429, P = 0 . 000）。進一
步做三因素 （HSF1基因、 熱休克預處理、 心理應激 ）析
因設計的方差分析 ,結果顯示:對 T迷宮轉換正確數
的影響 , HSF1基因具有主效應 （ F 1, 65 = 64 . 47, P =
0 . 00） ,心理應激具有主效應 （ F 1, 65 = 17 . 61, P =0 . 00） ,而熱應激沒有主效應 （ F 1, 65 = 0 . 32, P =
0 . 57） , HSF1基因與心理應激具有一階交互作用
（ F 1, 65 = 14 . 62, P = 0 . 00）。對 HSF1基因與心理應
激的一階交互作用做簡單效應分析 ,發現在 HSF1 - /
-小鼠中 ,心理應激可以引起 T迷宮轉換正確數明顯
減少 （ F 1, 65 = 32 . 39, P = 0 . 00） ,而在 HSF1 + / +小
鼠中心理應激沒有引起 T迷宮轉換正確數明顯減少
（ F 1, 65 = 0 . 23, P = 0 . 64）。見表 1。
表 1 T迷宮轉換正確數 （次 , x ±s ）
組別 NS PS HS HS + PS
HSF1 + / + 9 . 58 ± 0 . 48
（ n = 12）
8 . 90 ± 0 . 46
（ n = 10）
9 . 17 ± 0 . 79
（ n = 6）
9 . 56 ± 0 . 63
（ n = 9）
HSF12/2 7 . 33 ± 0 . 43
（ n = 12）
4 . 00 ± 0 . 263
（ n = 6）
6 . 60 ± 0 . 40
（ n = 5）
3 . 60 ± 0 . 243
（ n = 5）
注:與 NS組, HS組比較,
3
P < 0. 05二、 熱休克蛋白表達
1 . HSP72表達:Western印跡分析法檢測海馬內
HSP72的表達 （見圖 1） 。結果顯示 , HSF12/2 各組小
鼠 HSP72表達顯著低于 HSF1 + / +各組小鼠。心理應激引起 HSP72表達在 HSF1 + / +小鼠 （ 1 . 35 ±
0 . 11）中顯著高于 HSF12/2 小鼠 （ 0 . 23 ±0 . 03, P =
0 . 00）。同時 ,熱應激預處理也誘導 HSP72表達在
HSF1 + / +小鼠中 （ 1 . 71 ±0 . 05 ）高于 HSF12/2 小鼠
（0 . 26 ± 0 . 03, P = 0 . 01）。
圖 1 HSF1 + / +和 HSF12/2 小鼠各組 HSP72表達
2 . HSP25表達:Western印跡分析法檢測海馬內
HSP25的表達 （見圖 2） ,結果顯示 , HSF12/2 各組小鼠
HSP25表達顯著低于 HSF1 + / +小鼠。心理應激引起
HSP25表達表達在 HSF1 + / +小鼠中 （ 1 . 05 ±0 . 03）
顯著高于 HSF12/2 小鼠 （ 0 . 26 ±0 . 02, P = 0 . 00）。同
時 ,熱應激預處理也誘導 HSP25表達在 HSF1 + / +小
鼠中 （1 . 33 ± 0 . 05）高于 HSF12/2 小鼠 （0 . 23 ± 0 . 08, P
= 0 . 01）。
圖 2 HSF1 + / +和 HSF12/2 小鼠各組 HSP25表達
討 論
本研究結果顯示:慢性社會心理應激不引起 HSF1
+ / +小鼠 T迷宮轉換正確數明顯減少 ,提示慢性社
會心理應激不損害 HSF1 + / +小鼠工作記憶 ,這與既
往的研究結果相符合[ 2 ]
。采用 HSF12/2 小鼠進一步探
討其機制發現 ,慢性社會心理應激引起 HSF12/2 小鼠 T
迷宮轉換正確數明顯減少 ,說明在沒有了 HSF1基因
后 ,慢性社會心理應激損害了 HSF12/2 小鼠的工作記
憶能力。因此提示慢性社會心理應激不引起工作記憶
能力損害 , HSF1基因及其所調控表達的蛋白質的內源
性表達在其中起著重要的作用 ,而這種保護作用是由
心理應激本身來激活的。
為探討 HSF1基因如何在心理應激中發揮保護作
用 ,本研究進一步比較 HSF1 + / +小鼠和 HSF12/2 小
鼠 HSP72、 HSP25表達的差異。結果發現:在 HSF1 + /
+小鼠 ,心理應激可誘導 HSP72、 HSP25在 HSF1 + /
+小鼠 PS組顯著增加;而 HSF12/2 小鼠由于剔除了
HSF1基因 ,其海馬內 HSP72、 HSP25表達被大大削弱。
這與心理應激不影響 HSF1 + / +小鼠工作記憶能力 ,
但損害 HSF12/2 小鼠工作記憶相符合。上述結果提示
慢慢性心理應激不影響工作記憶能力 ,這一保護作用是
通過心理應激激活 HSF1而實現的 , HSP72、 HSP25大
量誘導表達在其中起著重要的作用。同時本研究發現
熱休克預處理也誘導 HSP72、 HSP25大量表達 ,但是并
沒有發現熱休克預處理誘導的 HSP72、 HSP25表達對
工作記憶具有保護性作用或損害作用 ,這與 McMorris
等人在青年志愿者中的研究結果是一致的。
本研究采用 HSF1基因敲除小鼠模型 ,證實
了慢性社會心理應激激活 HSF1基因 ,誘導熱休克蛋
白表達 ,在慢性社會心理應激中對工作記憶發揮了自
我保護的作用 ,揭示了慢性社會心理應激過程中機體
的自我保護機制 ,具有重要的理論和現實意義。