如何選擇合適的二抗

二抗是在其它宿主體內(nèi)制備的能與一抗或一抗片段結(jié)合的抗體，上面通常連有酶、熒光素或生物素等耦聯(lián)標記。二抗針對某一特定物種（如小鼠）的所有抗體（如IgG、IgM或IgA等）均具有反應(yīng)性，因而使用標記的二抗可以免去對每個一抗進行標記，大大節(jié)省了時間和費用；此外，一個一抗分子可以同時結(jié)合幾個二抗分子，從而使信號大大增強，提高了實驗靈敏度。通常情況下，某一特定的實驗中可能同時有幾種二抗可供選擇，如何能選擇到該實驗的二抗，需要綜合以下幾個方面進行考慮：

1.選擇全IgG形式還是F（ab’）2片段，或者Fab片段二抗。全IgG形式的二抗是從抗血清中分離出來的完整的分子；這些抗體有一個Fc部分和兩個與抗原結(jié)合的Fab部分，因此是二價的，也是的。F（ab’）2片段形式的二抗是用胃蛋白酶消化IgG去除Fc部分，剩下兩個靠二硫鍵連接的結(jié)合抗原的Fab部分，依然是二價的；該抗體可避免與Protein A /G或與Fc受體的結(jié)合，還由于其分子本身比較好，更容易滲透入細胞組織結(jié)構(gòu)內(nèi)而靈敏度更高。Fab片段形式的二抗是用木瓜蛋白酶消化IgG后得到的；Fab片段抗體由于只含有一個結(jié)合位點，可用來封閉內(nèi)源性的免疫球蛋白。

Tips：二價的抗體（全IgG 或F（ab’）2片段）不能用來封閉，因為它們有二個結(jié)合位點。封閉后，一些結(jié)合位點可能會暴露出來，與一抗結(jié)合，從而導(dǎo)致高的背景或假陽性標記。

2. 根據(jù)一抗的種屬來源和類型選擇二抗。二抗應(yīng)選用與使用的一抗相同的物種來源，例如：如果一抗是小鼠源的抗體，二抗則選抗小鼠的二抗；如果一抗是從兔血清里制備的兔源抗體，則相應(yīng)的二抗需要選擇抗兔的二抗。另外，二抗需與一抗的類別或亞類相匹配。這通常是針對單克隆抗體而言。其中單克隆抗體的類別及亞類通常會在產(chǎn)品說明書中都會有描述，如果一抗是小鼠IgM，那么相應(yīng)的二抗就應(yīng)當是抗小鼠IgM。如果一抗是小鼠IgG的某一亞類（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3），那么幾乎所有的抗小鼠IgG都可以與之結(jié)合，或者你也可以選擇專門針對這一亞類的二抗，例如，如果你的一抗是小鼠IgG1，那么你可以選擇抗IgG1的二抗。至于二抗本身是在什么動物中制備的對二抗的質(zhì)量并無明顯的影響。

Tips：多克隆抗體主要是IgG類免疫球蛋白，因此相應(yīng)的二抗就是抗IgG抗體；在不清楚一抗為何種類/亞類的情況下，可以選用抗相應(yīng)物種的IgG二抗。

3. 根據(jù)實驗要求的特異性進一步篩選二抗。Anti‐IgG （H+L）是zui常用也是的二抗形式，這類抗體和IgG分子的重鏈和輕鏈都可以反應(yīng)，也可以和其他的免疫球蛋白家族（IgM，IgA，IgD,IgE）和亞家族反應(yīng)，因為所有的免疫球蛋白都有相同的輕鏈。Anti‐IgG，F(xiàn)c fragment specific這類抗體和IgG重鏈的Fc部分反應(yīng)，與F（ab’）2或Fab無交叉反應(yīng)，但可能與IgM或IgA有交叉反應(yīng)；而抗IgG，F(xiàn)cγfragment specific則只與IgG重鏈反應(yīng)，通常不能和IgA或IgM任何表位反應(yīng)。Anti‐IgG，F(xiàn)（ab’）2 fragment specific則與Anti‐IgG，F(xiàn)c fragment specific則正好相反。另外，與一個物種反應(yīng)的二抗可能與其他物種發(fā)生交叉反應(yīng)，除非這類抗體經(jīng)過其他物種的血清蛋白吸附實驗。如Jackson 的Horseradish Peroxidase‐conjugated AffiniPure Mouse Anti‐Goat IgG （H+L） （min X Ms, Hu, Rb Sr Prot） 小鼠抗山羊二抗，就是經(jīng)過了小鼠、人、兔血清的吸附，其與小鼠、人、兔血清內(nèi)蛋白（包括免疫球蛋白）的交叉反應(yīng)降到zui低。當其他物種免疫球蛋白的出現(xiàn)可能導(dǎo)致交叉反應(yīng)時，推薦使用這類抗體。

Tips：有關(guān)于封閉的小建議

（1）當使用的是帶標記的二抗時，不能用一抗來源物種的正常血清和IgG來封閉。

（2）BSA和奶粉是zui為常用的封閉液，但可能含有牛IgG，與抗牛/山羊/綿羊/馬等二抗有較強的反應(yīng)。這時推薦用來自二抗來源物種的正常血清（5% v/v）封閉。

（3）針對Fc受體的非特異性雜交，可以使用二抗來源的血清、IgG等直接封閉；也可以使用去除Fc的F（ab‘）2 一抗來直接檢測；如果一抗全IgG，可以在4℃將細胞預(yù)培養(yǎng)于含有疊氮鈉和二抗來源物種正常血清的緩沖液中。