Organoid Cryopreservation Medium（Serum Free）

類器官凍存液

? 分裝后的類器官培養基需儲存于2-8 ℃，有效期兩年

1、 產品描述

模基生物類器官凍存液【Organoid Cryopreservation Medium（Serum Free）】可應用于多種哺乳動物（如人、鼠、豬、蝙蝠、牛等）來源的類器官和細胞系的低溫長期保存，該凍存液不含血清，不含任何動物來源成分，含有10%DMSO。

2、 產品信息

3、 其他自備材料和試劑

4、 類器官或細胞的凍存和復蘇

a)     類器官的凍存

1、   實驗準備：觀察類器官狀態，代次為3~5代，避免選擇已分化、代次過大進行凍存。若是狀態較差，可更換培養基培養至類器官狀態良好時凍存。準備好細胞凍存程序降溫盒置于室溫平衡溫度。以下步驟與細胞接觸的離心管、試管或者塑料吸頭需要用類器官培養防粘附潤洗液潤洗后使用。

2、   凍存前處理：選擇類器官生長狀態良好的培養孔，在保留原培養液的條件下（或者吸去培養液加入等體積的基礎培養基），用細胞刮刀或者移液器輕輕刮下（或吹打）基質膠和類器官混合物，轉移至1.5ml或15ml離心管中，吹打5~10次，使類器官和基質膠分離，100~300g離心3分鐘。若還有基質膠可用預冷基礎培養基清洗幾次，盡量去除基質膠，避免細胞無法與凍存保護液充分接觸，或者按照說明書使用類器官回收液去除基質膠。

注：在凍存體積過大的或者是多層上皮的/鱗狀細胞組成的類器官時，由于這類結構緊密，難以使用機械力分散，可使用類器官消化液適當消化5~15分鐘再使用上皮類器官基礎培養基清洗2次后進行凍存。

3、   添加凍存液：向準備凍存的類器官中加入500~1000μL預冷的凍存液（1×10?個/mL），吹打混勻后迅速轉移至細胞凍存管中。

4、   程序降溫和長期保存：將低溫凍存管放入細胞凍存程序降溫盒內，隨后迅速將細胞凍存程序降溫盒放入-80℃超低溫冰箱中，24小時后將凍存管轉移至液氮（-196℃）中長期保存。也可將凍存管進行人工梯度降溫處理，如4℃靜置10min，-20℃保存1小時，-80℃保存過夜，再轉移至液氮中長期保存。

b)      細胞的凍存

1、   實驗前準備：選取處于對數生長期的細胞，在凍存前一天換一次培養液。

2、   細胞收集：

2.1、貼壁細胞：吸棄舊培養液，使用PBS潤洗細胞后再加入適量溶液把單層生長的細胞消化下來，加入培養基終止消化，收集于離心管中離心，1000rpm，3min。

2.2懸浮生長的細胞則直接收集于離心管中離心，1000rpm，3min。

3、   離心后去除上清液，加入適量預冷的凍存培養液，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，計數，調節細胞濃度在5×10?-1×10?/mL之間。

4、   添加凍存液：向準備凍存的細胞中加入500~1000μL預冷的凍存液（1×10?個/mL），吹打混勻后迅速轉移至細胞凍存管中。

5、   程序降溫和長期保存：將低溫凍存管放入細胞凍存程序降溫盒內，隨后迅速將細胞凍存程序降溫盒放入-80℃超低溫冰箱中，24小時后將凍存管轉移至液氮（-196℃）中長期保存。也可將凍存管進行人工梯度降溫處理，如4℃靜置10min，-20℃保存1小時，-80℃保存過夜，再轉移至液氮中長期保存。

c)      類器官或細胞的復蘇

1、   提前在37℃條件下預熱類器官或細胞所需的上皮類器官基礎培養基。

2、   在37℃的水浴中快速解凍細胞凍存管，當凍存管內凍存物僅剩些許冰渣殘留時立即停止水浴并及時轉移至潔凈操作臺。

3、   將凍存懸液轉移至離心管中，緩緩加入5-10倍體積的預熱的基礎培養基，輕輕混勻。

4、   將上步驟所獲類器官或細胞懸液進行離心（水平離心轉子，150-300g，3min），棄上清，再次加入基礎培養基重懸類器官或細胞沉淀。

5、   將上步驟所獲類器官或細胞懸液進行離心（水平離心轉子，150-300g，3min），棄上清后所獲類器官或細胞可用于后續類器官或細胞的培養。

V2.0版

更新時間：2025/6/21