▍點突變斑馬魚模型構建

人類致病基因單核苷酸變異（SNV）的精準解析是精準醫學發展的重要基礎。隨著全基因組測序在臨床診斷中的推廣應用，臨床醫生和科研人員在罕見病、神經發育障礙等疾病中已鑒定出大量SNV，然而根據ClinVar（地球臨床變異公共數據庫）的統計（截至2024年）超過70%的錯義突變因缺乏功能證據被歸類為“意義未明（VUS）”，亟需通過功能性動物模型進行驗證。斑馬魚與人類在單基因遺傳病相關基因中共享70%-80%的直系同源基因，且關鍵蛋白功能結構域的氨基酸序列同源性可達85%以上（Howe K, et al., 2013），使其成為模擬人類致病SNV的理想模型。利用堿基編輯技術模擬特定SNV的精準斑馬魚模型不僅能闡明基因型-表型關聯，還可通過其胚胎和幼魚通量化藥篩系統為個體化治療方案制定提供臨床前驗證平臺。

堿基編輯技術通過CRISPR/Cas9衍生物與脫氨酶的融合系統，在不誘發DNA雙鏈斷裂的前提下實現C>T或A>G的精準堿基替換，其單堿基編輯效率可達50%-80%，為精確復現人類SNV提供了高效工具。

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▍成功案例 

Axenfeld–Rieger綜合征（ARS）是一種臨床上多樣化的常染色體顯性遺傳疾病，其特征是眼前節異常，顱面和牙齒不規則，心血管畸形以及其他導水管周圍皮膚。PITX2中的p.Q50 * 突變與引起ARS有關。

圖1. 斑馬魚pitx2 Q48* gRNA靶向圖

使用寬松編輯基序限制且高效的堿基編輯器zTad-SpRY-BE4max進行靶向編輯后（Zheng S, et al., 2025），成功在斑馬魚中構建了精準模擬人類PITX2 Q50*的pitx2 Q48*模型，pitx2 Q48*純合子F1突變體在5 dpf時表現出前房發育不足和顱面畸形，反映了人類ARS病例中的表型特征。

圖2. 斑馬魚pitx2 Q48*純合子突變體F1表型（紅色箭頭指示眼部前房發育不足，虛線顯示顱骨畸形）

▍參考文獻

1、斑馬魚參考基因組序列及其與人類基因組的關系

The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome

斑馬魚已成為研究脊椎動物基因功能的重要模式生物。它們的胚胎幾乎透明，并且可以通過基因敲低或過表達來加快遺傳學研究的進程，因此斑馬魚被廣泛用于脊椎動物基因功能的深入研究，并逐漸應用于人類遺傳疾病的研究。

然而，要有效構建人類遺傳疾病的模型，了解斑馬魚基因及其結構與人類同源基因之間的對應關系至關重要。為此，我們構建了一個高質量的斑馬魚基因組序列圖譜。該圖譜由一套重疊的、完整測序的大插入克隆組成，并通過高分辨率、高密度的減數分裂圖譜進行了排序與定位。

通過詳細的自動化和人工注釋，我們鑒定出超過26,000個蛋白編碼基因，是目前已測序脊椎動物中已知基因數量最多的物種。與人類參考基因組的比對結果顯示，大約70%的人類基因在斑馬魚中都能找到至少一個明顯的同源基因。

此外，這一高質量的基因組組裝還揭示了多個重要的基因組特征，例如其不同的重復序列結構、假基因數量少、第4號染色體上斑馬魚單有基因的富集現象，以及與性別決定相關的染色體區域。

2、攜帶提前終止密碼子（PTC）的mRNA通過Upf3a和COMPASS復合物組分引發遺傳補償反應

PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components

遺傳補償反應（GCR）近年來被提出，用以解釋基因敲除和基因敲低實驗中觀察到的表型差異。然而，GCR的分子機制尚不清楚。在本研究中，我們利用斑馬魚的capn3a和nid1a基因的敲低與敲除模型，發現攜帶提前終止密碼子（PTC）的mRNA可迅速誘發一種涉及Upf3a和COMPASS復合物組分的遺傳補償反應。

我們觀察到，capn3a敲低胚胎表現出肝臟發育不良，nid1a敲低胚胎則表現出體長縮短，但相應的基因敲除突變體卻表現正常。這一差異被歸因于同一家族中其他基因的上調表達。

通過設計六種轉基因模型，我們進一步證實，GCR的激活不僅依賴于PTC的存在，還依賴于轉基因mRNA序列，及其與內源性補償基因的同源性。研究還發現，無義介導的mRNA降解通路中的Upf3a，以及COMPASS復合物中的關鍵成分如Wdr5，在GCR中發揮重要作用。

此外，我們還發現，GCR的發生伴隨著補償性基因轉錄起始位點區域組蛋白H3第4位賴氨酸三甲基化（H3K4me3）水平的上調。

這些發現為GCR提供了可能的分子機制基礎，并有望為治療與錯義突變相關的遺傳疾病提供新策略——通過在突變基因中引入PTC，或引入含有PTC的轉基因，來激活GCR以達到治療的目的。

3、斑馬魚全基因組編輯中不依賴序列環境的TadA衍生胞嘧啶堿基編輯器

Sequence Context-Agnostic TadA-Derived Cytosine Base Editors for Genome-Wide Editing in Zebrafish

單核苷酸變異（SNVs）是與多種疾病密切相關的重要遺傳變異形式。CRISPR介導的堿基編輯技術已成為研究SNV致病機制的重要工具，尤其適用于斑馬魚這一理想的疾病模型和藥物篩選平臺。然而，目前應用于斑馬魚的胞嘧啶堿基編輯器（CBEs）普遍存在編輯窗口寬泛、序列依賴性強等問題，限制了其應用效果。

在本研究中，我們通過在TadA8e酶中引入關鍵突變，開發出一系列斑馬魚專用的TadA衍生胞嘧啶堿基編輯器，命名為zTadA-CBEs。這些新型編輯器在編輯效率和精度方面均顯著提升。其中，zTadA-BE4max與zTadA-BEmv提供了互補的編輯窗口，而zTadA-SpRY-BE4max則實現了對PAM序列更為靈活的編輯能力。

我們借助zTadA-CBEs成功建立了一個精準的Axenfeld-Rieger綜合征模型，并構建了兩個Hermansky-Pudlak綜合征的新模型。同時，還建立了一個新型白化病模型，其F0代個體攜帶兩個致病SNVs。

在功能恢復實驗中，我們設計了特異性sgRNA，將fmsts±錯義突變由T糾正為野生型的C，有效恢復了巨噬細胞數量至正常水平。

研究結果表明，zTadA-CBEs顯著提高了基因組編輯的能力，并為開發SNV相關疾病的治療策略提供了有力支持。