基于重組原理的無縫克隆技術是一種新一代的克隆方法，不需要繁瑣的酶消化、連接步驟或末端拋光。它允許通過將DNA片段與線性化載體末端的15~25nt同源序列重組，將插入片段克隆到線性化載體的任何位置。該載體的自連接背景極低，是一種簡單、快速、高效的DNA定向克隆技術。FlyCut™ DNA組裝Mix-Plus無縫克隆試劑盒能夠在單個反應中重組單個或多個DNA片段。它可以在5分鐘內實現單片段重組，陽性率超過95%。添加到混合物中的輔助因子有效地提高了克隆陽性率，優化的反應系統可以在一定程度上耐受未純化的PCR產物中的雜質。無血清克隆試劑盒的升級版具有更高的陽性率和更好的兼容性。

艾美捷快速多片段DNA無縫克隆預混液：

Cat #: C-BSM1202

Size: 50 rxns

Storage: -20°C

快速多片段DNA無縫克隆預混液：

組件   規格

FlyCut“DNA組裝混合物+250μl

pUC19對照質粒，線性化（安培，40納克/μl）50μl

500 bp對照片段（20納克/μl）50μl

快速多片段DNA無縫克隆預混液使用說明：

1.工作流程概述

2.線性化克隆載體的制備

選擇合適的克隆位點并將載體線性化。載體的線性化可以通過酶切或反向PCR擴增來實現。

① 酶消化制劑

一些限制性內切酶不能有效地消化超螺旋DNA，這可能導致不同數量的載體DNA未消化，導致陽性率降低。建議使用FlyCutTM快速限制酶進行消化（單次或雙次消化），以確保載體的完-全線性化并減少轉化背景（從未消化的載體中獲得假陽性克隆）。

注1：通過酶消化制備的線性化載體不需要去磷酸化。建議進行雙重消化。

注2：消化后，建議滅活限制性內切酶或純化所需產物，用于組合反應。

② 反向PCR擴增制備

為了盡量減少擴增突變的引入，建議使用高保真度PCR混合物進行擴增。建議使用預線性化的質粒作為模板，以減少殘留的環狀質粒模板對克隆陽性率的影響。

注1：如果PCR產物沒有顯示出特定的條帶，建議使用模板消除劑消化質粒模板，用于重組反應。否則，建議對PCR產物進行純化。

注2：對于多片段克隆，建議在使用前對PCR產物進行純化。

3.插入片段的PCR引物的設計

PCR引物的5'端必須包含與相鄰片段（插入片段或載體）端同源的15~25nt（推薦18nt）序列。如果矢量有粘性末端，并且3'末端突出，則底漆設計必須包括突出部分。如果5’端突出，底漆設計可以包括或排除突出部分。插入片段的正向擴增引物：

5'-上游載體同源序列+限制性位點（可選）+基因特異性正向擴增

序列-3'

插入片段的反向擴增引物：

3'-基因特異性反向擴增序列+限制性位點（可選）+下游同源載體

序列-5'

注1：建議選擇沒有重復序列、GC含量一致的區域進行克隆。當載體克隆位點上游和下游的25nt區域中的GC含量在40%和60%之間時，實現了較高的重組效率。

4.插入片段的PCR擴增

建議使用高保真度PCR混合物，以盡量減少擴增突變的引入。建議使用純化的PCR產物進行無縫克隆反應。如果通過瓊脂糖凝膠電泳將PCR產物鑒定為特異性擴增產物，則可以直接使用，但添加的體積不應超過總反應體積的20%。

5.重組反應

6.重組產品的轉化

取5-10μl反應混合物，加入100μl感受態細胞中。輕輕移液管并緩慢混合，然后放在冰上30分鐘。在42°C下加熱休克45-60秒，然后在冰上孵育5分鐘。加入500μl SOC或LB培養基，在37℃下振蕩40-60分鐘（200 rpm）。將細菌溶液均勻地涂抹在含有相應抗生素的瓊脂板上，并在37°C下孵育過夜。

7.陽性克隆檢測：

取單個菌落與10μl ddH20混合。在95°C下孵育10分鐘進行裂解后，取1μl裂解液作為平板進行菌落PCR鑒定。或者，將單個菌落接種在含有抗生素的培養基中并培養過夜，然后提取質粒進行酶消化鑒定。對于陽性克隆檢測中的陽性對照，使用通用引物M13F和M13R進行克隆PCR，使用Hindll和EcoRI進行酶消化鑒定。

注1：建議在菌落PCR中至少使用一種通用引物，以避免假陽性結果。

注2：如有必要，可對陽性結果進行進一步測序鑒定。