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武漢原生原代生物醫藥科技有限公司

PriCells: 正常人甲狀腺細胞的原代培養方法

時間:2021-10-20 閱讀:200
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PriCells: 正常人甲狀腺細胞的原代培養方法                                                                                   PDF下載
 
實驗材料:
1.      甲狀腺細胞材料來源:人孤立性良性甲狀腺腺瘤旁邊正常組織、甲狀腺功能亢進甲狀腺組織或甲狀腺腫瘤組織均可作為研究的材料;
2.      不含Ca2+和Mg2+的1×PBS,添加200000IU/L青霉素、200mg/L鏈霉素,pH7.2;
3.      培養用液:DMEM培養液,含15%—20%小牛血清、0.6mmol/L的HEPES、12.5mmol/L的谷氨酰胺、100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素。用5.6%的NaHCO3溶液調節pH值至7.0左右;
4.      消化液:0.25%胰蛋白酶溶液;
5.      培養器具:培養瓶或皿、孔徑為100μm的不銹鋼網篩、眼科剪、鑷子等;
 
培養方法:
1.將所取材料放入加有PBS的無菌容器中,立即送至培養室,時間不超過30min。若不能立即培養,可放在培養液站,置4℃下保存,但時間不炒股4h為宜;
2.在無菌條件下,將組織移至平皿內,用PBS洗滌2—3次。用眼科鑷剝離去除被膜及結締組織,并擠壓出其中的血液成分;
3.用眼科剪將組織剪成1mm3大小的勻漿狀,移入瓶內。加入比細胞多5—10倍量的消化液,于37℃水浴條件下消化30—60min。每隔5—10min搖動1次;
4.消化完畢,加入冷的PBS終止消化。通過孔徑100μm的不銹鋼網篩過濾。收集濾液于離心管中,以1500r/min離心10min。吸去上清液,將細胞沉淀再用PBS漂洗2次。離心棄上清液。收集未通過篩網的組織,加消化液置37℃水浴條件下繼續消化15—30min,并過篩合并。在漂洗后的細胞沉淀中加入一定量的培養液,用吸管吹打數次,制成細胞懸液;
5.吸取少量細胞懸液,加入臺盼藍染液,在血細胞計數板上計數。活細胞比例應大于90%。用培養液稀釋細胞至密度為5×105—10×105個/ml;
6.接種細胞懸液到培養瓶或培養皿中。于37℃、含5%CO2培養箱中培養;
7.次日,吸出培養液以去掉未貼壁的細胞,加入新鮮培養液,以后每隔3—5天換液1次;

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