一、目的

學(xué)習(xí)紫外分光光度法測(cè)定核酸含量的原理和操作方法，熟悉紫外分光光度計(jì)的基本原理和使用方法。

二、原理

核酸、核苷酸及其衍生物的分子結(jié)構(gòu)中的嘌呤、嘧啶堿基具有共軛雙健系統(tǒng)（-C=C一C=C-），能夠強(qiáng)烈吸收250-280nm 波長(zhǎng)的紫外光。核酸（DNA,RNA）的zui大紫外吸收值在260nm 處。遵照Lambert-Beer 定律，可以從紫外光吸收值的變化來測(cè)定核酸物質(zhì)的含量。

在不同pH 溶液中嘌呤、嘧啶堿基互變異構(gòu)的情況不同，紫外吸收光也隨之表現(xiàn)出明顯的差異，它們的摩爾消光系數(shù)也隨之不同。所以，在測(cè)定核酸物質(zhì)時(shí)均應(yīng)在固定的pH溶液中進(jìn)行。

核酸的摩爾消光系數(shù)（或吸收系數(shù)），通常以ε（ρ）來表示，即每升含有一摩爾核酸磷的溶液在260nm 波長(zhǎng)處的消光值（即光密度，或稱為光吸收）。核酸的摩爾消光系數(shù)不是一個(gè)常數(shù)，而是依賴于材料的前處理、溶液的pH 和離子強(qiáng)度發(fā)生變化。它們的經(jīng)典數(shù)值（pH = 7.0）如下：

DNA 的ε（ρ）= 6 000 - 8 000

RNA 的ε（ρ）= 7 000 - 10 000

小牛胸腺DNA 鈉鹽溶液（pH = 7.0）的ε（ρ）= 6 600，DNA 的含磷量為9.2%，含1μg/mL DNA 鈉鹽的溶液光密度為0.020。RNA 溶液（pH = 7.0）的ε（ρ）= 7 700-7 800，RNA 的含磷量為9.5%，含1μg /mL RNA 溶液的光密度為0.022-0.024。采用紫外分光光度法測(cè)定核酸含量時(shí)，通常規(guī)定：在260nm 波長(zhǎng)下，濃度為1μg/mL 的DNA 溶液其光密度為0.020，而濃度為1μg/mL 的RNA 溶液其光密度為0.024。因此，測(cè)定未知濃度的DNA（RNA）溶液的光密度OD₂₆₀nm，即可計(jì)算測(cè)出其中核酸的含量。該法簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高，如核酸3μg/mL 的含量即可測(cè)出。對(duì)于含有微量蛋白質(zhì)和核苷酸等吸收紫外光物質(zhì)的核酸樣品，測(cè)定誤差較小，若樣品內(nèi)混雜有大量的上述吸收紫外光物質(zhì)，測(cè)定誤差較大，應(yīng)設(shè)法事先除去。由于降解或水解作用，核酸的光密度可以增高約40%，這就是*的增色效應(yīng)（hyperchromic effect）。在大分子的核酸中，氫鍵和π-鍵相互作用改變了堿基的共振行為。因此，核酸的光密度低于構(gòu)成它的核苷酸的光密度，該現(xiàn)象稱為減色效應(yīng)（hypochromic effect）。

三、實(shí)驗(yàn)材料、主要儀器和試劑

1.試材：核酸樣品DNA 或RNA。

2. 主要儀器

（1）分析天平

（2）紫外分光光度計(jì)

（3）冰浴或冰箱

（4）離心機(jī)

（5）離心管（10mL）

（6）燒杯（10mL）

（7）容量瓶（50mL、100mL）

（8）移液管（0.5ml、2mL 和5mL）

（9）藥品勺和玻璃棒

（10）試管和試管架。

3.試劑

（1）5%~6%氨水：用25%~30%氨水稀釋5 倍。

（2）鉬酸銨-過氯酸試劑：取3.6mL70%過氯酸和0.25g 鉬酸銨溶于96.4mL 蒸餾水中。

四、操作步驟

1.核酸樣品純度的測(cè)定

（1）準(zhǔn)確稱取待測(cè)的核酸樣品0.5g，加少量蒸餾水（或無離子水）調(diào)成糊狀，再加適量的水，用5%-6%氨水調(diào)至pH7,定容至50mL.

（2）取兩支離心管，甲管內(nèi)加入2mL 樣品溶液和2mL 蒸餾水；乙管內(nèi)加入2mL 樣品溶液和2mL 沉淀劑（沉淀除去大分子核酸，作為對(duì)照）。混勻，在冰浴（或冰箱）中放置30min，3 000r/min 離心10min。從甲、乙兩管中分別取0.5mL 上清液，用蒸餾水定容至50mL.選用光程為1cm 的石英比色杯，在260nm 波長(zhǎng)下測(cè)其光密度。

（3）計(jì)算

如果待測(cè)的核酸樣品不含酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，則可將樣品配制成一定濃度的溶液（20-50μg/mL）在紫外分光光度計(jì)上直接測(cè)定。

2.核酸溶液含量的測(cè)定

當(dāng)待測(cè)的核酸樣品中含有酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，在測(cè)定時(shí)需要加鉬酸銨-過氯酸沉淀劑，沉淀除去大分子核酸，測(cè)定上清液260 nm 處光密度作為對(duì)照。

（1）取2 支離心管，每管各加入2mL 待測(cè)的核酸溶液，再向甲管內(nèi)加2mL 蒸餾水，向乙管內(nèi)加2mL 沉淀劑。混勻，在冰浴（或冰箱）中放置10min，3 000r/min 離心10min。將甲、乙兩管清液分別稀釋至光密度在0.1-1.0 之間。選用光程為1cm 的石英比色杯，在260nm 波長(zhǎng)下測(cè)其光密度OD260nm。

（2）計(jì)算