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武漢原生原代生物醫藥科技有限公司

利用Hoechst 33342外流性質分選原代角膜間質干細胞

時間:2021-10-21 閱讀:258
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PriCells: 利用Hoechst 33342外流性質分選原代角膜間質干細胞


試劑和材料:
1. 2—4代的間質細胞;
2. HBSS/2FB;
3. Hoechst 33342染料,1mg/ml水溶;
4. 碘化丙啶(PI),2mg/ml水溶;
5. 維拉帕米,500μg/ml水溶;
6. DEME/2FB;
7. 胰蛋白酶/TrypLE:TrypLE Express或0.25%胰蛋白酶,溶于CMF-Saline G;
8. MoFlo(或與其類似的)高速細胞分選儀,具備350nm激發能力;


實驗方法:
1. 用PriCells原代細胞分離試劑盒2—4代的間質細胞;
2. 細胞計數,用DMEM/2FB將細胞稀釋至1×106/cm2個細胞/ml;
3. 加入5μg/ml Hoechst 33342染料,37℃,90min,每20min攪動一次;
4. 對照組細胞在加入Hoechst 33342染料前,先加入50μg/ml維拉帕米孵育20min;
5. 染色后,在4℃環境下用HBSS/2FB將細胞洗兩遍并離心,之后在冰上用冷HBSS/2FB重懸細胞;
6. 于分選前加入2μg/ml PI以鑒別無活性的細胞;
7. 無菌條件下分選細胞,高速細胞分選儀,用350nm激發。收集藍色(670nm)和紅色(450nm)熒光均減弱的細胞。邊群細胞通過上述步驟與死細胞和*被染料標記的細胞分離開并被收集起來。對照組要確保用維拉帕米先行孵育后使邊群細胞消失;


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