RT-PCR（AMV）試劑盒

產品簡介

RT-PCR（AMV）試劑盒用于在總RNA、mRNA等RNA模板的基礎上反轉錄產生cDNA*鏈，然后通過PCR反應擴增cDNA的全過程試劑盒。本試劑盒包含了進行cDNA*鏈合成和PCR反應所需的各種試劑。可用于檢測mRNA的表達水平、克隆特定基因的cDNA 斷。試劑盒提供了Oligo(dT)18和隨機引物這兩種引物，前者適合用于帶有Poly(A)尾的mRNA的反轉錄，后者進行反轉錄時不需要poly(A)尾。也可以自行采用基因特異性引物進行cDNA*鏈的合成。同時還提供了PCR反應的陽性對照β-actin的上、下游引物。

試劑盒以外自備儀器和試劑
無RNase酶的1.5m L離心管，可調移液器，PCR儀，無RNase的無菌水，設計好的目的基因引物。

保存條件：

-20℃保存，一年有效。

注意事項：

為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

操作規程

  A、RT反應

1、 使用前每個組份輕輕混勻，然后2000rpm離心20s。

2、 取滅過菌且無核酸酶的0.2ml PCR管，參考如下表格設置反轉錄反應（20 μL反應體系）：

3、   輕輕混勻(可以用Vortex在zui低速度輕輕混勻或用移液器吹打混勻)，隨后2000rpm離心20s沉淀液體。

4、   如果使用Oligo(dT)18作為引物或使用基因特異性引物，在42℃孵育60分鐘。如果使用隨機引物作為引物，先在25℃孵育10分鐘，隨后在42℃孵育60分鐘。注意：對于GC含量比較高的RNA模板的反轉錄反應，可以設置為45℃孵育60min。

5、   70℃孵育10min以失活逆轉錄酶并終止反轉錄反應。

6、   反轉錄產物可以直接用于下一步的PCR反應，也可以-20℃凍存以備以后使用。

B、PCR反應（50μL體系）

（如客戶需要使用更小量的反應體系，試劑加樣量按比例進行減少）：

1、   使用前每個組份輕輕混勻，然后2000rpm離心20s。

2、 取滅過菌的0.2ml PCR管，參考如下表格設置反轉錄反應（50 μL反應體系）：

（如果有多個類似的PCR反應，可以先配制大體積的包含水、buffer、dNTP和Taq酶的混合物，然后分裝到各PCR反應管內。根據情況，有時混合物中也可以包括引物）

3、   輕輕混勻(可以用Vortex在zui低速度輕輕混勻或用移液器吹打混勻)，隨后2000rpm離心20s沉淀液體。

4、   如果所使用的PCR儀有熱蓋則省略本步驟。如果PCR儀沒有熱蓋，則在管內滴入一滴礦物油。

5、 各設置好的PCR反應管置于PCR儀上，開始PCR反應。

a、  ,   PCR擴增條件參考：

  Step1(起始變性)：    94℃ 3min

Step2(變性)：        94℃ 30sec

Step3(退火)：        45～65℃ 30sec

Step4(延伸)：        72℃ 1min

Step5(循環)：        Go To Step2 for 25～35 cycles

Step6(zui終延伸)：    72℃ 10min

Step7(臨時保存)：    4℃ forever

b、   PCR反應的設置需根據模板、引物、PCR產物的長度和GC含量等條件的不同設定不同的PCR反應條件包括溫度、時間、循環數及鎂離子的濃度等。

c、 Step4(延伸)的時間設置需根據PCR產物的長度進行設置，通常每kb產物的延伸時間為1分鐘。例如PCR產物的長度為1kb，則延伸時間可以設置為1分鐘，PCR產物的長度為2kb，則延伸時間可以設置為2分鐘，以此類推。

d、 對于初次進行的PCR，為盡量確保可以擴增出預期的PCR產物，可以把循環數設置為35。對于需進行半定量或定量的PCR反應循環數一定要進行適當優化，使PCR反應沒有達到平臺期。

6、   反應結束后，取反應液10μL進行瓊脂糖凝膠電泳，確認PCR反應產物。如果此PCR產物需用于以后實驗，應將PCR產物冷凍保存。

RT-PCR（AMV）試劑盒

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RT-PCR（AMV）試劑盒

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