HPLC如何檢測蛋白質(zhì)純度？原理與操作流程全解析檢測技術服務詳情介紹

dànbáizhì純度是影響下游實驗可靠性和產(chǎn)品質(zhì)量的核心指標。高效液相色譜（High-Performance Liquid Chromatography, HPLC）以其zhuóyuè的分離能力和定量精度，成為蛋白純度檢測的重要手段。本文將解析HPLC檢測dànbáizhì純度的原理、操作流程及優(yōu)化策略。

一、HPLC檢測dànbáizhì純度的原理

HPLC利用固定相與流動相間的相互作用差異，將樣品中不同組分分離，進而定量分析目標蛋白的純度。根據(jù)蛋白的理化特性，常用HPLC方法包括：

1、尺寸排阻色譜（SEC）

• 原理：通過多孔填料對dànbáizhì分子的排阻作用實現(xiàn)分離。分子量較大的組分先洗脫，較小組分后洗脫。

• 應用：適用于檢測蛋白聚集體、降解產(chǎn)物等高分子雜質(zhì)。

2、反相色譜（RP-HPLC）

• 原理：依賴蛋白疏水性與固定相（如C18柱）間的疏水作用力分離。疏水性較強的組分與固定相結(jié)合更緊密，延遲洗脫。

• 應用：用于分析蛋白純度、結(jié)構(gòu)完整性，特別對疏水區(qū)結(jié)構(gòu)變化敏感。

3、離子交換色譜（IEX）

• 原理：基于蛋白表面電荷與帶相反電荷的固定相（陽離子或陰離子交換劑）間的靜電相互作用實現(xiàn)分離。通過調(diào)節(jié)流動相中鹽濃度或pH梯度，分離不同電荷異構(gòu)體。

• 應用：適合檢測蛋白的電荷異質(zhì)性及雜質(zhì)含量。

二、dànbáizhì純度HPLC檢測的標準操作流程

1、樣品準備

• 將蛋白樣品溶解于適當緩沖液（如PBS），確保wánquán溶解。

• 采用0.22 μm過濾器除去微粒，防止堵塞色譜柱。

• 控制進樣濃度在系統(tǒng)建議范圍（通常為0.1–5 mg/mL），避免柱過載。

2、色譜系統(tǒng)準備與條件設定

• 根據(jù)目標蛋白選擇合適的色譜柱（SEC、RP、IEX）。

• 配制并過濾流動相，確保與樣品及柱兼容，防止析出物堵塞系統(tǒng)。

• 設定流速、柱溫（通常為25–40℃）及檢測波長（常用280 nm）。

3、系統(tǒng)平衡與樣品進樣

• 使用流動相平衡色譜系統(tǒng)（約10–30分鐘），確?；€穩(wěn)定。

• 采用自動進樣或手動進樣，注意進樣體積的jīngzhǔn控制。

4、洗脫及檢測

• SEC通常采用等度洗脫，保持流動相組成恒定。

• RP-HPLC和IEX多采用線性或階梯梯度洗脫，提高分辨率。

• 通過紫外檢測器（UV）監(jiān)控洗脫峰，繪制色譜圖。

5、數(shù)據(jù)分析與純度計算

• 提取色譜圖中主峰（目標蛋白）及雜質(zhì)峰面積，計算純度百分比。通用公式：純度（%） = （主峰面積 ÷ 所有峰面積總和） × 100

• 為確保結(jié)果準確可靠，建議進行多次進樣，并結(jié)合自動積分與峰識別功能分析。

三、提高檢測準確性的關鍵要點

• 合理選擇色譜柱：依據(jù)蛋白的分子量、疏水性或電荷特性，選擇匹配的分離模式。

• 優(yōu)化流動相組成：保證流動相的pH、鹽濃度與蛋白穩(wěn)定性相容，減少樣品降解或非特異性結(jié)合。

• 系統(tǒng)維護與柱保護：定期清洗流路和色譜柱，避免殘留物污染影響分析結(jié)果。

• 梯度洗脫策略：對于復雜樣品，可通過優(yōu)化梯度條件實現(xiàn)更高分辨率分離。

• 定量結(jié)果驗證：通過多次獨立進樣、使用外標或內(nèi)標法驗證數(shù)據(jù)穩(wěn)定性與準確度。

HPLC以其高分辨率、良好重復性和高靈敏度，已成為dànbáizhì純度檢測bùkěhuòquē的核心技術。深入理解其原理與操作流程，合理選擇色譜模式并優(yōu)化參數(shù)，是確保實驗成功的關鍵。百泰派克生物科技憑借優(yōu)良的色譜分析平臺和經(jīng)驗豐富的技術團隊，能夠提供從方法開發(fā)、系統(tǒng)搭建到數(shù)據(jù)解析的一體化解決方案。我們結(jié)合高分辨率分離技術與嚴格質(zhì)量控制體系，為科研人員與企業(yè)客戶提供高質(zhì)量、可重復、數(shù)據(jù)可追溯的蛋白純度檢測服務。

百泰派克生物科技特色項目

一、蛋白測序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos質(zhì)譜儀及島津公司埃德曼降解測序系統(tǒng)對dànbáizhì序列進行分析，提供基于質(zhì)譜的蛋白測序分析服務，包括對dànbáizhì的氨基酸組成分析，Nduāncèxù，Cduāncèxù和全序列分析，以及基于埃德曼降解的dànbáizhìN端序列分析服務。對于未知理論序列的dànbáizhì，提供基于從頭測序法的dànbáizhì從頭測序服務，對蛋白序列進行分析。

※服務優(yōu)勢：

1.采用目前世界上優(yōu)良的質(zhì)譜儀器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可實現(xiàn)對所測定靶蛋白序列 100% 的覆蓋;

3.可測定蛋白N端多達 70個氨基酸序列;

4.可測定多種形式的樣品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白條帶;

5.樣品用量低: 蛋白樣品僅需 5-10ug，即可完成檢測;

6.測序不受N端封閉，PEC和和糖基化等N端修飾的影響。

二、dànbáizhì組學

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos質(zhì)譜平臺結(jié)合Nano-LC，提供定量dànbáizhì組學、bǎxiàngdàn白zhìzǔxué、多肽組學、翻譯后修飾蛋白組學等多種dànbáizhì組學分析服務。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4Ddànbáizhì組學服務，助力微量樣本蛋白組學、大樣本群醫(yī)學及高通量修飾組學等研究工作。

※服務優(yōu)勢：

1 .高通量定量蛋白分析:多對照組大規(guī)模實驗分析，發(fā)現(xiàn)新的生物標記物;

2.體內(nèi)體外多種dànbáizhì標記方法，適用于分析組織、細胞、血液等多種樣品;

3.質(zhì)譜分析靈敏度高，實驗結(jié)果重復度高;

4.可檢測較低豐度蛋白，線性范圍廣;

5.zhuānyè生物信息學分析，分析更系統(tǒng)準確。

三、單細胞質(zhì)譜流式技術分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm質(zhì)譜流式系統(tǒng)進行單細胞質(zhì)譜流式技術分析，采用金屬元素標記物（通常是金屬元素標記的特異抗體）標記細胞表面和內(nèi)部的分子，然后用流式細胞原理分離單個細胞，再用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）分析單個細胞的原子質(zhì)量譜，zuì后將原子質(zhì)量譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為細胞表面和內(nèi)部的信號分子表達量。

※服務優(yōu)勢：

1.技術優(yōu)良，*技術空白

采用金屬標記抗體技術，避免了傳統(tǒng)流式熒光通道少且易相互影響的問題?？稍趩渭毎麑用嫔蠈Χ喾N指標同時進行表征，百泰派克生物科技可做到同時檢測51個目標蛋白。

2.分析數(shù)量大，成本較低

單細胞RNAseq受成本等因素限制，所有樣本細胞匯總的分析數(shù)目一般在2x10^4個左右，而流式質(zhì)譜技術一次（單樣本）就可分析至少10^5的細胞，實現(xiàn)了數(shù)量級的提高，且成本不高于單細胞RNAseq。

3.應用前景大

①流式質(zhì)譜結(jié)果可以給出細胞亞群的變化，在臨床診斷、疾病機制研究等方面具有極大的研究前景；

②將金屬標簽技術與其他技術結(jié)合會有新應用方向。除常規(guī)蛋白外，質(zhì)譜流式細胞技術還可用于蛋白翻譯后修飾；

③可檢測細胞存活率、細胞大小、mRNA轉(zhuǎn)錄子表達量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度質(zhì)譜的免疫多肽組學分析及新抗原發(fā)現(xiàn)

百泰派克生物科技的基于高精度質(zhì)譜的免疫多肽組學分析及新抗原發(fā)現(xiàn)一站式解決方案包括我們專有的、高度敏感的免疫肽富集和鑒定方案。我們能夠幫助您實現(xiàn)10,000個以上I型多肽和10,000個以上II型多肽的鑒定和識別。通過我們優(yōu)化的高通量免疫多肽組學分析平臺進行免疫肽組學分析，可從zuì小的樣品材料中進行可重復的識別和定量。該服務可以應用于大規(guī)模的研究，旨在助力科研工作者尋找癌癥、免疫疾病及傳染病的解決方案，深入挖掘未知的靶標。

五、生物藥物表征

百泰派克基于高分辨率質(zhì)譜技術，MALDI TOF，高效色譜分離技術，提供一系列完善的生物藥物分析方案，從dànbáizhì、多肽、抗體、疫苗等生物制品的氨基酸組成和一級結(jié)構(gòu)分析，到產(chǎn)品變異性和純度分析。旨在提供優(yōu)質(zhì)生物藥物分析服務，幫助生物醫(yī)藥生產(chǎn)商提高生物藥物品質(zhì)。

百泰派克生物科技七大檢測平臺

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物質(zhì)譜多組學優(yōu)質(zhì)服務商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于為生物/制藥和醫(yī)療器械行業(yè)提供質(zhì)量控制檢測和項目驗證等zhuānyè服務。公司實驗室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法規(guī)和指導原則，通過CNAS/ISO9001雙重質(zhì)量體系認證，建立了完備的質(zhì)量體系，數(shù)據(jù)冷熱/異地備份，設備定期計量/期間核查，軟件審計追蹤，為客戶提供一體化解決方案和技術服務，支持新藥研發(fā)、藥物申報注冊和生產(chǎn)放行。

1.公司采用ISO9001質(zhì)量控制體系，zhuānyè提供以質(zhì)譜為基礎的CRO檢測分析服務；

2.獲國家CNAS實驗室認可，為客戶提供符合全球藥政法規(guī)的藥物質(zhì)量研究服務；

3.業(yè)務范圍覆蓋dànbáizhì組學、多肽組學、代謝組學、生物藥物表征、單細胞分析、單細胞質(zhì)譜流式、生信云分析以及多組學生物質(zhì)譜整合分析等；

4.七大質(zhì)量控制檢測平臺，滿足您一站式服務需求；

5.服務3000+企業(yè)，10000+客戶的選擇；

6.致力于為您提供優(yōu)質(zhì)的生物質(zhì)譜分析服務!

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